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CDC-006-00019, Revision: 05 CDC / DDID / NCIRD / Abteilung für Viruserkrankungen
Gültig ab: 13.07.2020
CDC 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV)
Echtzeit-RT-PCR-Diagnose-Panel
Nur für den Notfall
Gebrauchsanweisung
Katalognummer 2019-nCoVEUA-01
1000 Reaktionen
Zur In-vitro- Diagnostik (IVD)
Nur Rx
Zentren für die Kontrolle und Prävention von Krankheiten
Abteilung für Viruserkrankungen
1600 Clifton Rd NE
Atlanta GA 30329

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Gültig ab: 13.07.2020
Inhaltsverzeichnis
Verwendungszweck ................................................ .................................................. ........................... 2
Zusammenfassung und Erklärung ............................................... .................................................. ...... 2
Verfahrensgrundsätze .............................................. .................................................. ..... 3
Erforderliche Materialien (bereitgestellt) ............................................. .................................................. .. 5
Erforderliche (aber nicht bereitgestellte) Materialien ........................................... ........................................ 6
Warnungen und Vorsichtsmaßnahmen ............................................... .................................................. ... 10
Lagerung, Handhabung und Stabilität der Reagenzien ........................................... .................................. 11
Probenentnahme, -handhabung und -lagerung ........................................... ............................ 12
Probenüberweisung an CDC .............................................. .................................................. ..... 13
Vorbereitung der Reagenzien und Kontrollen .............................................. .......................................... 13
Allgemeine Vorbereitung ................................................ .................................................. ............. 14
Nukleinsäureextraktion ............................................... .................................................. ......... 14
Assay einrichten ............................................... .................................................. .......................... 16
Erstellen Sie eine Ausführungsvorlage für die Fast Dx-Echtzeit-PCR von Applied Biosystems 7500
Instrument (Erforderlich, wenn keine Vorlage vorhanden ist) .......................................... ............................... 20
Definieren der Geräteeinstellungen .............................................. ............................................ 26
Ausführen eines Tests ............................................... .................................................. ....................... 29
Interpretation der Ergebnisse und Berichterstattung ............................................. .................................. 34
Interpretationshandbuch für die Ergebnisse des 2019-nCoV rRT-PCR-Diagnosepanels ............................ 36
Qualitätskontrolle ................................................ .................................................. ...................... 37
Einschränkungen ................................................. .................................................. ........................... 37
Zulassungsbedingungen für das Labor ............................................ ....................... 38
Leistungsmerkmale ................................................ ................................................. 39
Verfügung ................................................. .................................................. ................................ 49
Verweise ................................................. .................................................. ........................... 49
Versionsgeschichte ................................................ .................................................. ................... 50
Kontaktinformationen, Bestellung und Produktsupport .......................................... ............... 50
Anhang A: Alternative zur Extraktion zur Wärmebehandlung .......................................... ............. 51

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Verwendungszweck
Das Echtzeit-RT-PCR-Diagnosepanel CDC 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) ist eine Echtzeit-RT-PCR
Test zum qualitativen Nachweis von Nukleinsäuren aus dem 2019-nCoV im oberen und unteren Bereich
Atemproben (wie Nasopharyngeal- oder Oropharyngealabstriche, Sputum, untere Atemwege
Aspirate, bronchoalveoläre Lavage und nasopharyngeale Waschung / Aspirat oder Nasenaspirat) gesammelt von
Personen, die die klinischen und / oder epidemiologischen Kriterien von 2019-nCoV erfüllen (z. B. klinische Anzeichen und
Symptome im Zusammenhang mit einer 2019-nCoV-Infektion, Kontakt mit einem wahrscheinlichen oder bestätigten 2019-nCoV-Fall,
Reisegeschichte zu geografischen Orten, an denen Fälle von 2019-nCoV festgestellt wurden, oder andere epidemiologische Fälle
Links, für die 2019-nCoV-Tests im Rahmen einer Untersuchung der öffentlichen Gesundheit angegeben werden können). Testen in
Die Vereinigten Staaten sind auf Laboratorien beschränkt, die gemäß der Clinical Laboratory Improvement zertifiziert sind
Änderungen von 1988 (CLIA), 42 USC § 263a, zur Durchführung von Tests mit hoher Komplexität.
Die Ergebnisse beziehen sich auf die Identifizierung von 2019-nCoV-RNA. Die 2019-nCoV-RNA ist im Allgemeinen im oberen Bereich nachweisbar
und Proben der unteren Atemwege während der Infektion. Positive Ergebnisse weisen auf eine aktive Infektion mit hin
2019-nCoV, schließen jedoch eine bakterielle Infektion oder eine Koinfektion mit anderen Viren nicht aus. Der Agent hat erkannt
ist möglicherweise nicht die eindeutige Ursache für eine Krankheit. Laboratorien in den Vereinigten Staaten und ihren Territorien sind
verpflichtet, alle positiven Ergebnisse den zuständigen Gesundheitsbehörden zu melden.
Negative Ergebnisse schließen eine Infektion mit 2019-nCoV nicht aus und sollten nicht als alleinige Grundlage für verwendet werden
Behandlung oder andere Patientenmanagemententscheidungen. Negative Ergebnisse müssen mit klinischen kombiniert werden
Beobachtungen, Anamnese und epidemiologische Informationen.
Das Testen mit dem Echtzeit-RT-PCR-Diagnosepanel CDC 2019-nCoV ist für geschulte Benutzer vorgesehen
Laborpersonal, das in der Durchführung von Echtzeit-RT-PCR-Assays kompetent ist. Der CDC 2019-Roman
Das Echtzeit-RT-PCR-Diagnose-Panel von Coronavirus (2019-nCoV) ist nur zur Verwendung unter einem Lebensmittel- und Arzneimittelmittel vorgesehen
Genehmigung für den Notfall der Verwaltung.
Zusammenfassung und Erklärung
Ein Ausbruch einer Lungenentzündung unbekannter Ätiologie in Wuhan City, Provinz Hubei, China, war zunächst
Bericht an die WHO am 31. Dezember 2019. Die chinesischen Behörden identifizierten ein neuartiges Coronavirus (2019-)
nCoV), was weltweit zu Millionen bestätigter Infektionen beim Menschen geführt hat. Fälle von asymptomatischen
Infektionen, leichte Krankheiten, schwere Krankheiten und Todesfälle wurden gemeldet.
Das CDC 2019-nCoV-Echtzeit-RT-PCR-Diagnosepanel ist ein molekularer In-vitro- Diagnosetest, der dabei hilft
der Nachweis und die Diagnose 2019-nCoV und basiert auf einer weit verbreiteten Nukleinsäureamplifikation
Technologie. Das Produkt enthält Oligonukleotidprimer und doppelt markierte Hydrolysesonden (TaqMan®).
und Kontrollmaterial, das in der rRT-PCR zum qualitativen In-vitro- Nachweis von 2019-nCoV-RNA in verwendet wird
Atemproben.
Der Begriff „qualifizierte Laboratorien“ bezieht sich auf Laboratorien, in denen alle Benutzer, Analysten und jede Person
Das Melden von Ergebnissen aus der Verwendung dieses Geräts sollte geschult werden, um die daraus resultierenden Ergebnisse durchzuführen und zu interpretieren
Verfahren vor der Verwendung durch einen kompetenten Ausbilder.

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Grundsätze des Verfahrens
Die Oligonukleotidprimer und -sonden zum Nachweis von 2019-nCoV wurden aus Regionen der
Virus-Nucleocapsid (N) -Gen. Das Panel ist für die spezifische Erkennung des 2019-nCoV (zwei) ausgelegt
Primer / Sonden-Sets). Ein zusätzlicher Primer / Sonden-Satz zum Nachweis des humanen RNase P-Gens (RP) in der Kontrolle
Proben und klinische Proben sind ebenfalls im Panel enthalten.
Aus Proben der oberen und unteren Atemwege isolierte und gereinigte RNA wird revers in cDNA transkribiert
und anschließend im Echtzeit-PCR-Instrument 7500 Fast Dx von Applied Biosystems mit SDS amplifiziert
Version 1.4 Software. Dabei glüht die Sonde an eine bestimmte Zielsequenz zwischen
die Vorwärts- und Rückwärtsprimer. Während der Verlängerungsphase des PCR-Zyklus beträgt die 5'-Nukleaseaktivität von
Taq-Polymerase baut die Sonde ab, wodurch sich der Reporterfarbstoff vom Quencherfarbstoff trennt.
Erzeugen eines fluoreszierenden Signals. Mit jedem Zyklus werden zusätzliche Reporterfarbstoffmoleküle abgespalten
ihre jeweiligen Sonden, wodurch die Fluoreszenzintensität erhöht wird. Die Fluoreszenzintensität wird bei überwacht
Jeder PCR-Zyklus von Applied Biosystems 7500 Fast Dx Echtzeit-PCR-System mit SDS Version 1.4-Software.
Der Nachweis von viraler RNA hilft nicht nur bei der Diagnose von Krankheiten, sondern liefert auch epidemiologische und
Überwachungsinformationen.

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Zusammenfassung des Vorbereitungs- und Testprozesses
Resuspendieren
Primer / Sonden-Mix,
Aliquot und lagern bei
≤ -20 ° C.
Resuspendieren und
Aliquot nCoVPC,
Bei -70 ° C lagern
Proben-RNA extrahieren
und HSC-RNA
Master Mix vorbereiten
(15 ul)
Bereiten Sie die rRT-PCR vor
Platte (5 & mgr; l RNA)
Führen Sie den Assay auf
ABI 7500Fast Dx
Daten analysieren
Ergebnisse melden
Nach Erhalt von
rRT-PCR-Panel
Reagenzien
Nach Erhalt
Stichprobe

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Erforderliche Materialien (bereitgestellt)
Hinweis: CDC wird auf seiner Website eine Liste der im Handel erhältlichen Primer- und Sondensätze führen
und / oder positive Kontrollmaterialien, die akzeptable Alternativen zum CDC-Primer- und Sondensatz sind
und / oder positive Kontrolle im Diagnosefeld. Nur Material, das über die CDC verteilt wird
Internationale Reagenzienressourcen und bestimmte Mengen an Material, die auf der CDC-Website veröffentlicht werden, sind zulässig
zur Verwendung mit diesem Assay unter der CDC-Genehmigung für den Notfall.
Diese Liste akzeptabler alternativer Chargen von Primer- und Sondenmaterialien und / oder Positivkontrollmaterialien
wird verfügbar sein unter:
https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-nCoV/lab/virus-requests.html
Primer und Sonden:
Katalog Nr. 2019-nCoVEUA-01 Diagnosefeldbox Nr. 1:
Reagenzienetikett
Teilenummer
Beschreibung
Menge /
Tube
Reaktionen /
Tube
2019-nCoV_N1
RV202001
RV202015
2019-nCoV_N1 Kombinierter Primer / Sonden-Mix
22,5 nmol
1000
2019-nCoV_N2
RV202002
RV202016
2019-nCoV_N2 Kombinierte Grundierung / Sondenmischung
22,5 nmol
1000
RP
RV202004
RV202018
Kombinierte Primer / Sonden-Mischung aus menschlichem RNase P.
22,5 nmol
1000
Positive Kontrolle (eines der folgenden Produkte ist akzeptabel)
Katalog Nr. 2019-nCoVEUA-01 Diagnosefeld Box Nr. 2:
Reagens
Etikette
Teilenummer
Beschreibung
Menge
Anmerkungen
nCoVPC
RV202005
Positive Kontrolle 2019-nCoV (nCoVPC)
Zur Verwendung als Positivkontrolle mit der CDC 2019-
nCoV Echtzeit-RT-PCR-Diagnosefeld
Verfahren. Das nCoVPC enthält nicht infektiös
Positivkontrollmaterial in getrocknetem Zustand geliefert
und muss vor Gebrauch resuspendiert werden. nCoVPC
besteht aus in vitro transkribierter RNA. nCoVPC wird
ergeben mit jedem Assay in der ein positives Ergebnis
2019-nCoV Echtzeit-RT-PCR-Diagnosefeld
einschließlich RP.
4 Röhren
Bietet
(800) 5 ul
Testreaktionen

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Katalognummer VTC-04 CDC 2019-nCoV-Positivkontrolle (nCoVPC)
Reagens
Etikette
Teilenummer
Beschreibung
Menge
Anmerkungen
nCoVPC
RV202005
Positive Kontrolle 2019-nCoV (nCoVPC)
Zur Verwendung als Positivkontrolle mit der CDC 2019-
nCoV Echtzeit-RT-PCR-Diagnosefeld
Verfahren. Das nCoVPC enthält nicht infektiös
Positivkontrollmaterial in getrocknetem Zustand geliefert
und muss vor Gebrauch resuspendiert werden. nCoVPC
besteht aus in vitro transkribierter RNA. nCoVPC wird
ergeben mit jedem Assay in der ein positives Ergebnis
2019-nCoV Echtzeit-RT-PCR-Diagnosefeld
einschließlich RP.
4 Röhren
Bietet
(800) 5 ul
Testreaktionen
Erforderliche Materialien (aber nicht bereitgestellt)
Human Specimen Control (HSC)
Beschreibung
Menge
CDC-Katalognummer
Hergestellt von CDC. Zur Verwendung als Nukleinsäureextraktionsverfahren
Kontrolle zum Nachweis einer erfolgreichen Gewinnung von Nukleinsäure sowie
Integrität des Extraktionsreagenzes. Das HSC besteht aus nicht infektiösen (beta-
Propiolacton-behandeltes) kultiviertes menschliches Zellmaterial, das als Flüssigkeit geliefert wird
suspendiert in 0,01 M PBS bei pH 7,2-7,4.
10 Fläschchen x 500 ul
KT0189
Akzeptable Alternativen zu HSC:
• Negatives menschliches Probenmaterial: Laboratorien können ein Volumen menschlicher Proben vorbereiten
Material (z. B. Humanseren oder gepoolte übrig gebliebene negative Atemwegsproben) zu extrahieren und
als Extraktionskontrolle neben klinischen Proben laufen lassen. Dieses Material sollte in vorbereitet werden
ausreichend Volumen, um über mehrere Läufe hinweg verwendet zu werden. Das Material sollte vor der Verwendung als getestet werden
die Extraktionskontrolle, um sicherzustellen, dass die erwarteten Ergebnisse für das darin aufgeführte HSC generiert werden
Gebrauchsanweisung.
• Erfundenes menschliches Probenmaterial: Laboratorien können erfundenes menschliches Probenmaterial herstellen
Materialien durch Suspendieren einer menschlichen Zelllinie (z. B. A549, Hela oder 293) in PBS. Dieses Material
sollte in ausreichendem Volumen vorbereitet werden, um über mehrere Läufe hinweg verwendet zu werden. Material sollte sein
vor der Verwendung als Extraktionskontrolle getestet, um sicherzustellen, dass die erwarteten Ergebnisse für generiert werden
das in dieser Gebrauchsanweisung aufgeführte HSC.
CDC wird auf seiner Website gegebenenfalls eine Liste kommerziell alternativer Extraktionskontrollen führen.
die für die Verwendung mit diesem Assay gemäß der CDC-Genehmigung zur Notfallverwendung zulässig sind, unter:
https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-nCoV/lab/virus-requests.html

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rRT-PCR-Enzym-Mastermix-Optionen
Reagens
Menge
Katalognummer
Quantabio qScript XLT Einstufiger RT-qPCR ToughMix
100 x 20 μl rxns
(1 x 1 ml)
95132-100
2000 x 20 μl rxns
(1 x 20 ml)
95132-02K
500 x 20 μl rxns
(5 x 1 ml)
95132-500
Quantabio UltraPlex 1-Schritt ToughMix (4X)
100 x 20 µL rxns
(500 ul)
95166-100
500 x 20 μl rxns
(5 x 500 ul)
95166-500
1000 x 20 μl rxns
(1 x 5 ml)
95166-01K
Promega GoTaq® Probe 1-Schritt RT-qPCR-System
200 x 20 μl rxns
(2 ml)
A6120
1250 x 20 μl rxns
12,5 ml
A6121
Thermofisher TaqPath ™ 1-Schritt RT-qPCR Master Mix, CG
1000 Reaktionen
A15299
2000 Reaktionen
A15300

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RNA-Extraktionsoptionen
Für jedes der unten aufgeführten Kits hat CDC bestätigt, dass der externe Lysepuffer für wirksam ist
Inaktivierung von SARS-CoV-2.
Instrument / Hersteller
Extraktionskit
Katalognummer
QIAGEN
2 Extraktionen des QIAmp DSP Viral RNA Mini Kit 50 (61904)
2 QIAamp Viral RNA Mini Kit
50 Extraktionen (52904)
250 Extraktionen (52906)
QIAGEN EZ1 Advanced XL
2 EZ1 DSP-Virus-Kit
48 Extraktionen (62724)
Puffer AVL (19073 oder 19089)
EZ1 Advanced XL DSP-Viruskarte (9018703)
2 EZ1 Virus Mini Kit v2.0
48 Extraktionen (955134)
Puffer AVL (19073 oder 19089)
EZ1 Advanced XL-Viruskarte v2.0 (9018708)
Roche MagNA Pure 24
2 MagNA Pure 24 Gesamt NA
Isolationskit
96 Extraktionen (07 658 036 001)
Externer Lysepuffer (06 374 913 001, 12 239 469
103, 03 246 779 001 oder 03 246 752 001)
Roche MagNA Pure 96
2 DNA und virales NA Small Volume
Kit
576 Extraktionen (06 543 588 001)
Externer Lysepuffer (06 374 913 001, 12 239 469
103, 03 246 779 001 oder 03 246 752 001)
1 Roche MagNA Pure LC
2 Gesamtnukleinsäure-Kit
192 Extraktionen (03 038 505 001)
1 Roche MagNA Pure Compact 2 Nucleic Acid Isolation Kit I.
32 Extraktionen (03 730 964 001)
Promega Maxwell® RSC 48
3 Maxwell® RSC Viral Total
Nucleic Acid Purification Kit
48 Extraktionen (AS1330)
144 Extraktionen (ASB1330)
1 QIAGEN QIAcube
2 Extraktionen des QIAmp DSP Viral RNA Mini Kit 50 (61904)
2 QIAamp Viral RNA Mini Kit
50 Extraktionen (52904)
250 Extraktionen (52906)
1, 3 bioMérieux NucliSENS®
easyMAG®
und
1, 3 bioMérieux EMAG®
(Automatisiert magnetisch
Extraktionsreagenzien verkauft
separat. Beide Instrumente
Verwenden Sie die gleichen Reagenzien und
Einwegartikel, mit dem
Ausnahme von Tipps.)
EasyMAG® Magnetic Silica (280133)
EasyMAG® Lysepuffer (280134)
EasyMAG® Lysepuffer, 2 ml (200292)
EasyMAG® Waschpuffer 1,2 und 3
(280130, 280131, 280132)
EasyMAG® Einwegartikel (280135)
Biohit-Pipettenspitzen (nur easyMAG®) (280146)
EMAG®1000μL-Tipps (418922)
1 Äquivalenz und Leistung dieser Extraktionsplattformen zur Extraktion von viraler RNA wurden mit der CDC nachgewiesen
Echtzeit-RT-PCR-Diagnose-Panel für das humane Influenzavirus (K190302). Leistungsmerkmale dieser Extraktion
Plattformen mit 2019-nCoV (SARS CoV-2) wurden nicht demonstriert.

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2 CDC hat bestätigt, dass der mit dieser Extraktionsmethode verwendete externe Lysepuffer zur Inaktivierung von SARS- wirksam ist.
CoV-2.
3 CDC hat die Konzentration des Inaktivierungsmittels im mit dieser Extraktionsmethode verwendeten Lysepuffer verglichen und hat
bestimmte, dass die Konzentration innerhalb des Konzentrationsbereichs liegt, der bei der Inaktivierung von SARS-CoV-2 als wirksam befunden wurde.
Alternative zur Extraktion:
Wenn ein Labor nicht auf geeignete Extraktionsreagenzien zugreifen kann, um den Testbedarf zu decken, aufgrund der
Aufgrund des weltweiten Mangels an Reagenzien hat CDC ein Wärmebehandlungsverfahren für die oberen Atemwege evaluiert
Proben mit dem Quantabio UltraPlex 1-Step ToughMix (4X), CG. Obwohl Leistung war
vergleichbar, diese Methode wurde mit einer begrenzten Anzahl von klinischen Proben bewertet und a
Eine mögliche Verringerung der Empfindlichkeit aufgrund der Verschleppung hemmender Substanzen oder des RNA-Abbaus ist nicht möglich
ausgeschlossen werden. Es sollte nur verwendet werden, wenn eine Gerichtsbarkeit feststellt, dass der Testbedarf groß ist
genug, um das Risiko eines möglichen Empfindlichkeitsverlustes zu rechtfertigen. Wärmebehandelte Proben erzeugen
Nicht eindeutige oder ungültige Ergebnisse sollten vorab mit einer autorisierten Extraktionsmethode extrahiert werden
erneutes Testen. Details und Verfahren für die Wärmebehandlungsalternative zur Extraktion finden Sie in
Anhang A.
Erforderliche Ausrüstung und Verbrauchsmaterialien (jedoch nicht bereitgestellt)
▪ Vortex-Mischer
▪ Mikrozentrifuge
▪ Mikropipetten (2 oder 10 μl, 200 μl und 1000 μl)
▪ Mehrkanal-Mikropipetten (5-50 μl)
▪ Gestelle für 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen
▪ 2 x 96-Well-Kühlblöcke bei -20 ° C.
▪ 7500 Fast Dx-Echtzeit-PCR-Systeme mit SDS 1.4-Software (Applied Biosystems; Katalog)
# 4406985 oder # 4406984)
▪ Extraktionssysteme (Instrumente): QIAGEN EZ1 Advanced XL, QIAGEN QIAcube, Roche MagNA
Pure 24, Roche MagNA Pure 96, Promega Maxwell® RSC 48, Roche MagNA Pure LC, Roche
MagNA Pure Compact, bioMérieux easyMAG und bioMérieux EMAG
▪ Wasser von molekularer Qualität, nukleasefrei
▪ 10% Bleichmittel (1:10 Verdünnung von handelsüblichem 5,25-6,0% Hypochloritbleichmittel)
▪ DNA Zap TM (Ambion, Kat. Nr. AM9890) oder gleichwertig
▪ RNase AWAY ™ (Fisher Scientific; Kat. Nr. 21-236-21) oder gleichwertig
▪ Puderfreie Einweghandschuhe und OP-Kittel
▪ Pipettenspitzen der Aerosolbarriere
▪ 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen (DNase / RNase-frei)
▪ 0,2 ml PCR-Reaktionsplatten (Applied Biosystems; Katalog Nr. 4346906 oder Nr. 4366932)
▪ MicroAmp Optical 8-Cap Strips (Applied Biosystems; Katalognummer 4323032)
Qualifizierende alternative Komponenten:
Wenn ein Labor diesen Test durch Verwendung nicht autorisierter alternativer Komponenten (z. B. Extraktion) ändert
Methoden oder PCR-Instrumente) ist der modifizierte Test nach dieser EUA nicht zugelassen. FDA-Richtlinie für
Diagnosetests für die Coronavirus-Krankheit 2019 während des Notfalls im Bereich der öffentlichen Gesundheit, aktualisiert am 11. Mai
2020 ändert dies nicht. Im Rahmen dieser Richtlinie beabsichtigt die FDA nicht, Einwände gegen ein Labor zu erheben
ändert einen von der EUA autorisierten Test, der die Verwendung nicht autorisierter Komponenten beinhalten könnte, ohne

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Erhalt einer EUA- oder EUA-Änderung, bei der der modifizierte Test anhand einer Überbrückungsstudie zur EU validiert wird
EUA-autorisierter Test.
Warnungen und Vorsichtsmaßnahmen
• Für die In-vitro- Diagnostik (IVD).
• Dieser Test wurde nicht von der FDA genehmigt oder genehmigt. Dieser Test wurde von der FDA unter genehmigt
eine EUA zur Verwendung durch Laboratorien, die gemäß CLIA, 42 USC § 263a, zertifiziert sind, um hohe Leistungen zu erbringen
Komplexitätstests.
• Dieser Test wurde nur zum Nachweis von Nukleinsäuren aus SARSCoV-2 zugelassen, nicht
für alle anderen Viren oder Krankheitserreger.
• Dieser Test ist nur für die Dauer der Erklärung zulässig, dass Umstände vorliegen
Begründung der Genehmigung der Notfallanwendung von In-vitro-Diagnosetests zum Nachweis
und / oder Diagnose von COVID-19 gemäß Abschnitt 564 (b) (1) des Gesetzes, 21 USC § 360bbb-
3 (b) (1), es sei denn, die Genehmigung wird früher beendet oder widerrufen.
• Befolgen Sie die üblichen Vorsichtsmaßnahmen. Alle Patientenproben und Positivkontrollen sollten berücksichtigt werden
potenziell ansteckend und entsprechend behandelt.
• Nicht essen, trinken, rauchen, Kosmetika auftragen oder Kontaktlinsen in Bereichen handhaben, in denen Reagenzien und
menschliche Proben werden behandelt.
• Behandeln Sie alle Proben wie infektiös mit sicheren Laborverfahren. Siehe Interim
Richtlinien zur biologischen Sicherheit im Labor für die Handhabung und Verarbeitung von Proben im Zusammenhang mit 2019-
nCoV https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-nCoV/lab-biosafety-guidelines.html.
• Die Probenverarbeitung sollte gemäß der nationalen biologischen Sicherheit durchgeführt werden
Vorschriften.
• Wenn aufgrund des aktuellen klinischen und epidemiologischen Screenings der Verdacht auf eine Infektion mit 2019-nCoV besteht
Von den Gesundheitsbehörden empfohlene Kriterien, mit denen Proben entnommen werden sollten
geeignete Vorsichtsmaßnahmen zur Infektionskontrolle.
• Leistungsmerkmale wurden mit menschlichen Proben der oberen Atemwege und bestimmt
Proben der unteren Atemwege von menschlichen Patienten mit Anzeichen und Symptomen der Atemwege
Infektion.
• Führen Sie alle Manipulationen an lebenden Virusproben innerhalb einer biologischen Sicherheit der Klasse II (oder höher) durch
Schrank (BSC).
• Verwenden Sie persönliche Schutzausrüstung wie (ohne darauf beschränkt zu sein) Handschuhe, Augenschutz und Labor
Schichten beim Umgang mit Kit-Reagenzien während der Durchführung dieses Assays und beim Umgang mit Materialien, einschließlich
Proben, Reagenzien, Pipetten und andere Geräte und Reagenzien.
• Amplifikationstechnologien wie PCR reagieren empfindlich auf versehentliches Einbringen von PCR-Produkten
aus früheren Amplifikationsreaktionen. Falsche Ergebnisse können auftreten, wenn entweder die klinische
Die Probe oder die im Amplifikationsschritt verwendeten Echtzeitreagenzien werden durch kontaminiert
versehentliche Einführung des Amplifikationsprodukts (Amplikon). Arbeitsablauf im Labor sollte
unidirektional vorgehen.
▪ Halten Sie separate Bereiche für den Assay-Aufbau und die Handhabung von Nukleinsäuren bereit.
▪ Überprüfen Sie vor der Verwendung immer das Verfallsdatum. Verwenden Sie keine abgelaufenen Reagenzien. Unterlassen Sie
Reagenzien aus verschiedenen Kit-Chargen oder von anderen Herstellern ersetzen oder mischen.
▪ Wechseln Sie die Pipettenspitzen der Aerosolbarriere zwischen allen manuellen Flüssigkeitstransfers.
▪ Bei der Probenvorbereitung ist die Einhaltung guter Labortechniken unerlässlich
um das Risiko einer Kreuzkontamination zwischen Proben und Versehen zu minimieren

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Einführung von Nukleasen in Proben während und nach dem Extraktionsverfahren. Richtig
Bei der Arbeit mit Nukleinsäuren sollte immer eine aseptische Technik angewendet werden.
▪ Warten Sie separate, dedizierte Geräte (z. B. Pipetten, Mikrozentrifugen) und Verbrauchsmaterialien
(z. B. Mikrozentrifugenröhrchen, Pipettenspitzen) zum Aufbau des Assays und zur Handhabung der extrahierten
Nukleinsäuren.
▪ Tragen Sie einen sauberen Laborkittel und puderfreie Einweghandschuhe (nicht zuvor getragen), wenn
Assays einrichten.
▪ Wechseln Sie die Handschuhe zwischen den Proben und bei Verdacht auf Kontamination.
▪ Reagenz- und Reaktionsröhrchen so weit wie möglich verschließen oder abdecken.
▪ Primer, Sonden (einschließlich Aliquots) und Enzym-Master-Mix müssen aufgetaut werden und
Während der Vorbereitung und Verwendung immer auf einem Kühlblock gehalten.
▪ Arbeitsflächen, Pipetten und Zentrifugen sollten gereinigt und dekontaminiert werden
Reinigungsprodukte wie 10% Bleichmittel, DNA Zap ™ oder RNase AWAY ™, um das Risiko zu minimieren
Nukleinsäurekontamination. Restbleichmittel sollten mit 70% Ethanol entfernt werden.
• Die RNA sollte während der Vorbereitung und Verwendung auf einem kalten Block oder auf Eis gehalten werden, um dies sicherzustellen
Stabilität.
• Entsorgen Sie nicht verwendete Kit-Reagenzien und menschliche Proben gemäß den örtlichen, staatlichen und bundesstaatlichen Bestimmungen
Vorschriften.
Lagerung, Handhabung und Stabilität der Reagenzien
• Lagern Sie alle getrockneten Primer und Sonden sowie die Positivkontrolle nCoVPC bei 2-8 ° C, bis sie erneut hydratisiert sind
verwenden. Lagern Sie flüssige HSC-Kontrollmaterialien bei ≤ -20 ° C.
Hinweis: Die Lagerinformationen beziehen sich auf CDC-Primer- und Sondenmaterialien, die über das
Internationale Reagenzienressource. Wenn Sie handelsübliche Primer und Sonden verwenden, lesen Sie bitte die
Anweisungen des Herstellers zur Lagerung und Handhabung.
• Überprüfen Sie vor der Verwendung immer das Verfallsdatum. Verwenden Sie keine abgelaufenen Reagenzien.
• Schützen Sie fluorogene Sonden vor Licht.
• Primer, Sonden (einschließlich Aliquots) und Enzym-Master-Mix müssen aufgetaut und kalt gehalten werden
Während der Vorbereitung und Verwendung jederzeit blockieren.
• Sonden nicht wieder einfrieren.
• Kontrollen und Aliquots der Kontrollen müssen während der Vorbereitung jederzeit aufgetaut und auf Eis gehalten werden
und verwenden.

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Probenentnahme, -handhabung und -lagerung
Eine unzureichende oder unangemessene Probenentnahme, -lagerung und -transport führen wahrscheinlich zu falschen Tests
Ergebnisse. Aufgrund der Bedeutung der Probe wird eine Schulung in der Probenentnahme dringend empfohlen
Qualität. CLSI MM13-A kann als geeignete Ressource referenziert werden.
➢ Entnahme der Probe
• Siehe vorläufige Richtlinien zum Sammeln, Behandeln und Testen klinischer Proben von
Untersuchte Patienten (PUIs) für das neuartige Coronavirus 2019 (2019-nCoV)
https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-nCoV/guidelines-clinical-specimens.html
• Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers des Probenentnahmegeräts für die richtigen Entnahmemethoden.
• Tupferproben sollten nur mit Tupfern mit einer synthetischen Spitze wie Nylon oder entnommen werden
Dacron ® und eine Aluminium- oder Kunststoffwelle. Calciumalginat-Tupfer sind inakzeptabel und
Wattestäbchen mit Holzschäften werden nicht empfohlen. Legen Sie die Tupfer sofort hinein
sterile Röhrchen, die 1-3 ml geeignetes Transportmedium enthalten, wie z. B. virales Transportmedium
(VTM).
➢ Proben transportieren
• Die Proben müssen gemäß der aktuellen Ausgabe von verpackt, versendet und transportiert werden
die Gefahrgutverordnung der International Air Transport Association (IATA). Folgen
Versandvorschriften für biologische Stoffe der UN 3373, Kategorie B beim Versand von Potenzialen
2019-nCoV-Proben. Lagern Sie die Proben bei 2-8 ° C und versenden Sie sie über Nacht auf einem Eisbeutel an CDC. Wenn ein
Die Probe wird bei -70 ° C oder niedriger eingefroren und über Nacht auf Trockeneis an CDC geschickt.
➢ Proben lagern
• Die Proben können nach der Entnahme bis zu 72 Stunden bei 2-8 ° C gelagert werden .
• Wenn eine Verzögerung der Extraktion zu erwarten ist, lagern Sie die Proben bei -70 ° C oder niedriger.
• Extrahierte Nukleinsäure sollte bei -70 ° C oder niedriger gelagert werden .

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Überweisung der Probe an CDC
Für staatliche und lokale Laboratorien für öffentliche Gesundheit:
• Versenden Sie alle Proben über Nacht an CDC.
• Versenden Sie gefrorene Proben auf Trockeneis und nicht gefrorene Proben auf Kühlpackungen.
Anforderungen finden Sie bei der International Air Transport Association (IATA - www.iata.org )
für den Versand von menschlichen oder potenziell infektiösen biologischen Proben. Folgen Sie dem Versand
Vorschriften für UN 3373 Biological Substance, Kategorie B beim Senden von potenziellen 2019-nCoV
Proben.
• Informieren Sie vor dem Versand die CDC-Abteilung für Viruserkrankungen (siehe Kontaktinformationen unten) darüber
Sie senden Proben.
• Senden Sie alle Proben an folgenden Empfänger:
Zentren für die Kontrolle und Prävention von Krankheiten
c / o STATT
Achtung: Einheit 66
1600 Clifton Rd., Atlanta, GA 30329-4027
Telefon: (404) 639-3931
Die Notrufnummer für das CDC Emergency Operations Center (EOC) lautet
770-488-7100 .
Alle anderen Labors, die CLIA-zertifiziert sind und die Anforderungen für eine hohe Komplexität erfüllen
testen:
• Bitte benachrichtigen Sie Ihr staatliches und / oder örtliches Labor für öffentliche Gesundheit über die Überweisung von Proben und
Anleitung für Bestätigungstests.
Vorbereitung des Reagenzes und der Kontrollen
HINWEIS: Die Lagerinformationen beziehen sich auf Materialien, die über die CDC International Regent Resource bezogen wurden.
Wenn Sie kommerzielle Produkte zum Testen verwenden, beachten Sie bitte die Anweisungen des Herstellers zur Lagerung.
Handhabungs- und Vorbereitungsanweisungen.
Vorbereitung des Primers und der Sonde:
1) Lagern Sie getrocknete Primer und Sonden nach Erhalt bei 2-8 ° C.
2) Vorsichtsmaßnahmen: Diese Reagenzien sollten nur an einem sauberen Ort gehandhabt und an einem geeigneten Ort gelagert werden
Temperaturen (siehe unten) im Dunkeln. Einfrieren-Auftauen-Zyklen sollten vermieden werden. Kalt halten
beim Auftauen.
3) Mit aseptischer Technik getrocknete Reagenzien in 1,5 ml nukleasefreiem Wasser suspendieren und einwirken lassen
15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln zu rehydrieren.
4) Vorsichtig mischen und Primer / Sonde in 300 μl Volumen in 5 vormarkierte Röhrchen aliquotieren. Speichern Sie a
einzelnes, funktionierendes Aliquot von Primern / Sonden bei 2-8 ° C im Dunkeln. Lagern Sie die restlichen Aliquots bei ≤ -
20 ° C in einem nicht frostfreien Gefrierschrank. Aufgetaute Aliquots nicht wieder einfrieren (bis zu 4 Monate haltbar bei
2-8 ° C).

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2019-nCoV-Positivkontrolle (nCoVPC) Vorbereitung:
1) Vorsichtsmaßnahmen: Dieses Reagenz sollte bei einem speziellen Umgang mit Nukleinsäuren mit Vorsicht behandelt werden
Bereich, um mögliche Kontaminationen zu verhindern. Einfrieren-Auftauen-Zyklen sollten vermieden werden. Behalten Sie bei
Eis beim Auftauen.
2) Das getrocknete Reagenz in jedem Röhrchen in 1 ml nukleasefreiem Wasser resuspendieren, um das richtige Ergebnis zu erzielen
Konzentration. Aliquots zum Einmalgebrauch (ca. 30 μl) herstellen und bei ≤ -70 ° C lagern .
3) Tauen Sie für jedes Experiment ein einzelnes Aliquot der verdünnten Positivkontrolle auf und halten Sie es auf Eis, bis
Hinzufügen zu Platte. Entsorgen Sie nicht verwendete Teile des Aliquots.
Human Specimen Control (HSC) (nicht bereitgestellt)
1) Human Specimen Control (HSC) oder eine der aufgeführten akzeptablen alternativen Extraktionskontrollen
muss bei jedem Probenextraktionslauf extrahiert und verarbeitet werden.
2) Anweisungen zur Verwendung finden Sie in der Packungsbeilage zur Human Specimen Control (HSC).
Keine Vorlagensteuerung (NTC) (nicht bereitgestellt)
1) Steriles, Nuklease-freies Wasser
2) Aliquot in kleinen Mengen
3) Wird verwendet, um während der Probenentnahme und / oder des Plattenaufbaus auf Verunreinigungen zu prüfen
Allgemeine Vorbereitung
Gerätevorbereitung
Reinigen und dekontaminieren Sie alle Arbeitsflächen, Pipetten, Zentrifugen und andere Geräte vor dem Gebrauch.
Dekontaminationsmittel sollten verwendet werden, einschließlich 10% Bleichmittel, 70% Ethanol und DNA zap ™ oder RNase
AWAY zur Minimierung des Risikos einer Nukleinsäurekontamination.
Nukleinsäureextraktion
Die Leistung des Echtzeit-RT-PCR-Diagnose-Panels CDC 2019-nCoV hängt von der Menge ab
und Qualität der aus menschlichen Proben gereinigten Matrizen-RNA. Folgendes im Handel erhältlich
RNA-Extraktionskits und -verfahren wurden für die Gewinnung und Reinheit von RNA qualifiziert und validiert
zur Verwendung mit dem Panel:
Qiagen QIAamp ® DSP Viral RNA Mini Kit oder QIAamp ® Viral RNA Mini Kit
Empfehlung (en): Verwenden Sie 100 μl Probe und eluieren Sie mit 100 μl Puffer oder verwenden Sie 140 μl
Probe und eluieren mit 140 μl Puffer.
Qiagen EZ1 Advanced XL
Kit: Qiagen EZ1 DSP-Virus-Kit und Buffer AVL (separat erhältlich) für die Offboard-Lyse
Karte: EZ1 Advanced XL DSP-Viruskarte
Empfehlung (en): Fügen Sie 120 μl Probe zu 280 μl voraliquotiertem Puffer AVL (Gesamteingabeprobe) hinzu
Volumen beträgt 400 μl). Fahren Sie mit der Extraktion auf dem EZ1 Advanced XL fort. Das Elutionsvolumen beträgt 120 μl.

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Kit: Qiagen EZ1 Virus Mini Kit v2.0 und Buffer AVL (separat erhältlich) für die Offboard-Lyse
Karte: EZ1 Advanced XL Virus Card v2.0
Empfehlung (en): Fügen Sie 120 μl Probe zu 280 μl voraliquotiertem Puffer AVL (Gesamteingabeprobe) hinzu
Volumen beträgt 400 μl). Fahren Sie mit der Extraktion auf dem EZ1 Advanced XL fort. Das Elutionsvolumen beträgt 120 μl.
Roche MagNA Pure 96
Kit: Roche MagNA Pure 96 DNA und Viral NA Small Volume Kit
Protokoll: Virales NA Plasma Ext LysExt Lys SV 4.0-Protokoll oder Virales NA Plasma Ext Lys SV-Protokoll
Empfehlung (en): 100 μl Probe zu 350 μl voraliquotiertem externem Lysepuffer (mitgeliefert) geben
separat) (das gesamte eingegebene Probenvolumen beträgt 450 μl). Fahren Sie mit der Extraktion auf dem MagNA Pure 96 fort.
( Interne Kontrolle = Keine) . Das Elutionsvolumen beträgt 100 μl.
Roche MagNA Pure 24
Kit: Roche MagNA Pure 24 Gesamt-NA-Isolationskit
Protokoll: Pathogen 1000 2.0-Protokoll
Empfehlung (en): 100 µl Probe zu 400 µl voraliquotiertem externen Lysepuffer (mitgeliefert) geben
separat) (das gesamte eingegebene Probenvolumen beträgt 500 µL). Fahren Sie mit der Extraktion auf dem MagNA Pure 24 fort.
( Interne Kontrolle = Keine ). Das Elutionsvolumen beträgt 100 µl.
Promega Maxwell® RSC 48
Kit: Promega Maxwell® Viral Total Nucleic Acid Purification Kit
Protokoll: Virale Gesamtnukleinsäure
Empfehlung (en): 120 µl Probe zu 330 µl voraliquotiertem externen Lysepuffer (300 µl) geben
Lysepuffer plus 30 µl Proteinase K; im Kit enthalten) (das gesamte Eingangsvolumen beträgt 450 µL). Vorgehen
mit der Extraktion auf dem Maxwell® RSC 48. Das Elutionsvolumen beträgt 75 µl.
Äquivalenz und Leistung der folgenden Extraktionsplattformen wurden mit der CDC demonstriert
Human Influenza Virus Echtzeit-RT-PCR-Diagnose-Panel (K190302) und basierend auf diesen Daten sind
Akzeptabel für die Verwendung mit dem CDC 2019-nCoV Echtzeit-RT-PCR-Diagnosepanel.
QIAGEN QIAcube
Kit: QIAGEN QIAamp® DSP Viral RNA Mini Kit oder QIAamp® Viral RNA Mini Kit
Empfehlungen: 140 μl Probe verwenden und mit 100 μl Puffer eluieren.
Roche MagNA Pure LC
Kit: Roche MagNA Pure Total Nucleic Acid Kit
Protokoll: Total NA External_lysis
Empfehlung (en): 100 μl Probe zu 300 μl voraliquotiertem Lysepuffer des TNA-Isolationskits geben
(Das gesamte eingegebene Probenvolumen beträgt 400 μl). Das Elutionsvolumen beträgt 100 μl.
Roche MagNA Pure Compact
Kit: Roche MagNA Pure Nucleic Acid Isolation Kit I.
Protokoll: Total_NA_Plasma100_400
Empfehlung (en): 100 μl Probe zu 300 μl voraliquotiertem Lysepuffer des TNA-Isolationskits geben
(Das gesamte eingegebene Probenvolumen beträgt 400 μl). Das Elutionsvolumen beträgt 100 μl.

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bioMérieux NucliSENS® easyMAG® Instrument
Protokoll: Allgemeines Protokoll (nicht für Blut) unter Verwendung der Reagenzieneinstellungen „Off-Board-Lyse“.
Empfehlung (en): 100 μl Probe zu 1000 μl voraliquotiertem easyMAG-Lysepuffer (insgesamt) geben
Das eingegebene Probenvolumen beträgt 1100 μl. 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Das Elutionsvolumen beträgt 100
μL.
bioMérieux EMAG® Instrument
Protokoll: Benutzerdefiniertes Protokoll: CDC Flu V1 unter Verwendung der Reagenzieneinstellungen „Off-Board-Lyse“.
Empfehlung (en): 100 μl Proben zu 2000 μl voraliquotiertem easyMAG-Lysepuffer (insgesamt) hinzufügen
Das eingegebene Probenvolumen beträgt 2100 μl. 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Das Elutionsvolumen beträgt 100
μL. Das benutzerdefinierte Protokoll CDC Flu V1 ist auf dem bioMérieux EMAG ® -Instrument mit dem programmiert
Unterstützung eines bioMérieux-Kundendienstmitarbeiters. Die Überprüfung der Installation ist zum Zeitpunkt von dokumentiert
Installation. Den Laboratorien wird empfohlen, Aufzeichnungen über die schrittweise Überprüfung der
Installationsverfahren für das benutzerdefinierte Protokoll von bioMérieux.
Vom Hersteller empfohlene Verfahren (außer wie in den obigen Empfehlungen angegeben) sind zu beachten
gefolgt für die Probenextraktion. HSC muss in jeder Extraktionscharge enthalten sein.
Haftungsausschluss: Namen von Anbietern oder Herstellern werden als Beispiele für geeignete Produktquellen angegeben. Aufnahme
bedeutet nicht, dass die Zentren für die Kontrolle und Prävention von Krankheiten dies befürworten .
Assay einrichten
Reaction Master Mix und Plattenaufbau
Hinweis: Die Konfiguration der Platteneinrichtung kann je nach Anzahl der Proben und Arbeitstag variieren
Organisation. NTCs und nCoVPCs müssen in jedem Lauf enthalten sein.
1) Legen Sie in der Reinraumhaube des Reagenzienaufstellungsraums rRT-PCR-Puffer, Enzym und Primer / Sonden auf
Eis oder Kühlblock. Während der Zubereitung und Verwendung kalt halten.
2) Puffer, Enzym und Primer / Sonden 5-mal durch Inversion mischen.
3) Reagenzien und Primer / Sonden 5 Sekunden lang zentrifugieren, um den Inhalt am Boden von zu sammeln
das Rohr, und dann legen Sie das Rohr in ein kaltes Gestell.
4) Beschriften Sie ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen für jeden Primer- / Sondensatz.
5) Bestimmen Sie die Anzahl der Reaktionen (N), die pro Assay durchgeführt werden sollen. Es ist notwendig, Überschuss zu machen
Reaktionsmischung für die NTC-, nCoVPC-, HSC- (falls im RT-PCR-Lauf enthalten) und RP-Reaktionen und
für Pipettierfehler. Verwenden Sie die folgende Anleitung, um N zu bestimmen:
• Wenn die Anzahl der Proben (n) einschließlich der Kontrollen 1 bis 14 beträgt, ist N = n + 1
• Wenn die Anzahl der Proben (n) einschließlich der Kontrollen 15 oder mehr beträgt, ist N = n + 2
7) Berechnen Sie für jeden Primer- / Sondensatz die Menge jedes Reagenzes, das für jedes hinzugefügt werden soll
Reaktionsgemisch (N = Anzahl der Reaktionen).

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Thermofisher TaqPath ™ 1-Schritt RT-qPCR Master Mix
Schritt #
Reagens
Vol. Reagenz hinzugefügt
pro Reaktion
1
Nukleasefreies Wasser
N x 8,5 ul
2
Kombinierte Grundierung / Sondenmischung
N x 1,5 ul
3
TaqPath TM 1-Schritt RT-qPCR Master Mix (4x)
N x 5,0 ul
Volle Lautstärke
N x 15,0 ul
Promega GoTaq® Probe 1-Schritt RT-qPCR-System
Schritt #
Reagens
Vol. Reagenz hinzugefügt
pro Reaktion
1
Nukleasefreies Wasser
N x 3,1 ul
2
Kombinierte Grundierung / Sondenmischung
N x 1,5 ul
3
GoTaq Probe qPCR Master Mix mit dUTP
N x 10,0 ul
4
Gehen Sie zu Script RT Mix für 1-Step RT-qPCR
N x 0,4 ul
Volle Lautstärke
N x 15,0 ul
Quantabio qScript XLT Einstufiger RT-qPCR ToughMix
Schritt #
Reagens
Vol. Reagenz hinzugefügt
pro Reaktion
1
Nukleasefreies Wasser
N x 3,5 ul
2
Kombinierte Grundierung / Sondenmischung
N x 1,5 ul
3
qScript XLT Einstufiger RT-qPCR ToughMix
(2X)
N x 10,0 ul
Volle Lautstärke
N x 15,0 ul
Quantabio UltraPlex 1-Schritt ToughMix (4X)
Schritt #
Reagens
Vol. Reagenz hinzugefügt
pro Reaktion
1
Nukleasefreies Wasser
N x 8,5 ul
2
Kombinierte Grundierung / Sondenmischung
N x 1,5 ul
3
UltraPlex 1-Schritt ToughMix (4X)
N x 5,0 ul
Volle Lautstärke
N x 15,0 ul

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8) Reagenzien in das jeweils gekennzeichnete 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen geben. Nach Zugabe von
Die Reagenzien mischen die Reaktionsmischungen durch Auf- und Abpipettieren. Nicht vortexen .
9) 5 Sekunden zentrifugieren, um den Inhalt am Boden des Röhrchens zu sammeln, und dann das
Rohr in einem kalten Gestell.
10) Richten Sie Reaktionsstreifenröhrchen oder -platten in einem 96-Well-Kühlregal ein.
11) 15 µl jeder Mastermischung wie gezeigt in die entsprechenden Vertiefungen in der Reihe geben
unten ( Abbildung 1 ):
Abbildung 1: Beispiel für den Aufbau der Reaktionsmaster-Mischplatte
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
EIN
N1
N1
N1
N1
N1
N1
N1
N1
N1
N1
N1
N1
B.
N2
N2
N2
N2
N2
N2
N2
N2
N2
N2
N2
N2
C.
RP
RP
RP
RP
RP
RP
RP
RP
RP
RP
RP
RP
D.
E.
F.
G
H.
12) Bereiten Sie vor dem Umzug in den Bereich zur Handhabung von Nukleinsäuren die No Template Control (NTC) vor.
Reaktionen für Spalte Nr. 1 im Assay-Vorbereitungsbereich.
13) Pipettieren Sie 5 µl Nuklease-freies Wasser in die NTC-Probenvertiefungen ( Abbildung 2 , Spalte 1). Sicher
Verschließen Sie die NTC-Vertiefungen, bevor Sie fortfahren.
14) Decken Sie die gesamte Reaktionsplatte ab und bewegen Sie die Reaktionsplatte zur Probennukleinsäure
Handhabungsbereich.
Zugabe von Nukleinsäuretemplaten
1) Nukleinsäure-Probenröhrchen vorsichtig ca. 5 Sekunden lang vortexen.
2) 5 Sekunden zentrifugieren, um den Inhalt am Boden des Röhrchens zu sammeln.
3) Stellen Sie nach der Zentrifugation die extrahierten Nukleinsäure-Probenröhrchen in das Kühlregal.
4) Proben sollten zu den Spalten 2-11 (Spalte 1 und 12 sind für Kontrollen) hinzugefügt werden
Assay, der wie in Abbildung 2 dargestellt getestet wird . Pipettieren Sie vorsichtig 5,0 µl der ersten Probe
in alle für diese Probe gekennzeichneten Vertiefungen (dh Probe "S1" in Spalte 2). Behalte andere
Probenvertiefungen während der Zugabe abgedeckt. Ändern Sie die Tipps nach jeder Zugabe.
5) Verschließen Sie die Säule, zu der die Probe hinzugefügt wurde, sicher, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden
und um die Probenverfolgung sicherzustellen.
6) Wechseln Sie die Handschuhe häufig und bei Bedarf, um eine Kontamination zu vermeiden.
7) Wiederholen Sie die Schritte 4 und 5 für die verbleibenden Proben.

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8) Falls erforderlich, 5 µl der mit Human Specimen Control (HSC) extrahierten Probe in die HSC-Vertiefungen geben
( Abbildung 2 , Spalte 11). Verschließen Sie die Vertiefungen nach der Zugabe sicher. HINWEIS: Gemäß CLIA-Bestimmungen gilt HSC
muss mindestens einmal pro Tag getestet werden.
9) Decken Sie die gesamte Reaktionsplatte ab und bewegen Sie die Reaktionsplatte zur Positivschablonenkontrolle
Handhabungsbereich.
Assay Control Addition
1) Pipettieren Sie 5 & mgr; l nCoVPC-RNA in die Probenvertiefungen von Spalte 12 ( 2 ) . Verschließen Sie die Vertiefungen sicher
nach Zugabe der Kontroll-RNA.
HINWEIS: Wenn Sie Streifen mit 8 Röhrchen verwenden, beschriften Sie die TAB jedes Streifens, um die Probenposition anzugeben. UNTERLASSEN SIE
ETIKETTIEREN SIE DIE TOPS DER REAKTIONSROHRE!
2) Reaktionsrohrstreifen 10-15 Sekunden lang kurz zentrifugieren. Nach dem Zentrifugieren wieder kalt werden
Gestell.
HINWEIS : Wenn 96-Well - Platten verwendet wird , Zentrifugenplatten für 30 Sekunden bei 500 xg, 4 ° C .
Abbildung 2. 2019-nCoV rRT-PCR-Diagnosefeld: Beispiel für den Proben- und Kontrollaufbau
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11 a
12
EIN
NTC
S1
S2
S3
S4
S5
S6
S7
S8
S9
S10 nCoV PC
B.
NTC
S1
S2
S3
S4
S5
S6
S7
S8
S9
S10 nCoV PC
C.
NTC
S1
S2
S3
S4
S5
S6
S7
S8
S9
S10 nCoV PC
D.
E.
F.
G
H.
a Ersetzen Sie die Probe in dieser Spalte bei Bedarf durch extrahiertes HSC

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Erstellen Sie eine Ausführungsvorlage für die Fast Dx-Echtzeit-PCR von Applied Biosystems 7500
Instrument (Erforderlich, wenn keine Vorlage vorhanden ist)
Wenn die Vorlage bereits auf Ihrem Instrument vorhanden ist, fahren Sie mit dem Abschnitt RUNNING A TEST fort .
1) Starten Sie das Echtzeit-PCR-Instrument 7500 Fast Dx von Applied Biosystems durch Doppelklicken auf
Applied Biosystems 7500 Fast Dx System-Symbol auf dem Desktop.
2) Es sollte ein neues Fenster angezeigt werden. Wählen Sie im Menü die Option Neues Dokument erstellen .
Abbildung 3. Fenster des Assistenten für neue Dokumente
3) Der Bildschirm des Assistenten für neue Dokumente in Abbildung 3 wird angezeigt . Wählen:
ein. Assay: Standardkurve (absolute Quantifizierung)
b. Behälter: 96-Well Clear
c. Vorlage: Leeres Dokument
d. Ausführungsmodus: Standard 7500
e. Betreiber: Ihr Name
f. Kommentare: SDS v1.4
G. Plattenname: Ihre Wahl
4) Nachdem Sie eine Auswahl getroffen haben, klicken Sie unten im Fenster auf Weiter .
Stellen Sie sicher, dass Sie sich ändern
Run Mode to
STANDARD 7500

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Abbildung 4. Neue Detektoren erstellen
HINWEIS: ROX ist die passive Standardreferenz. Dies wird in Schritt 12 in "keine" geändert.
5) Nach Auswahl von Weiter wird der Bildschirm Detektoren auswählen ( Abbildung 4 ) angezeigt .
6) Klicken Sie auf die Schaltfläche Neuer Detektor (siehe Abbildung 4 ).
7) Das Fenster Neuer Detektor wird angezeigt ( Abbildung 5 ). Für muss ein neuer Detektor definiert werden
jeder Primer und Sondensatz. Durch das Erstellen dieser Detektoren können Sie jeden Primer und analysieren
Sondensatz einzeln am Ende der Reaktion.

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Abbildung 5. Neues Detektorfenster
8) Erstellen Sie zunächst den N1-Detektor. Das Folgende einschließen:
ein. Name: N1
b. Beschreibung: leer lassen
c. Reporter Dye: FAM
d. Quencher Dye: (keine)
e. Farbe: Um die Farbe der Detektoranzeige zu ändern, gehen Sie wie folgt vor:
Klicken Sie auf das Farbquadrat, um die Farbkarte anzuzeigen
Wählen Sie eine Farbe aus, indem Sie auf eines der Quadrate klicken
Klicken Sie nach Auswahl einer Farbe auf OK , um zum Bildschirm Neuer Detektor zurückzukehren
f. Klicken Sie im Bildschirm Neuer Detektor auf die Schaltfläche OK , um zum in Abbildung 4 gezeigten Bildschirm zurückzukehren .
9) Wiederholen Sie Schritt 6-8 für jedes Ziel im Bedienfeld.
Name
Reporter Dye
Quencher Dye
N1
FAM
(keiner)
N2
FAM
(keiner)
RP
FAM
(keiner)

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10) Nachdem jeder Detektor hinzugefügt wurde, werden die Felder Detektorname , Beschreibung , Reporter und Quencher angezeigt
wird im Bildschirm Detektoren auswählen angezeigt ( Abbildung 6 ).
11) Bevor Sie fortfahren, müssen die neu erstellten Detektoren zum Dokument hinzugefügt werden. Hinzufügen der
Wenn Sie neue Detektoren im Dokument haben, klicken Sie auf HINZUFÜGEN (siehe Abbildung 6 ). Detektornamen werden auf dem angezeigt
rechte Seite des Fensters Detektoren auswählen ( Abbildung 6 ).
Abbildung 6. Hinzufügen neuer Detektoren zum Dokument
12) Wenn alle Detektoren hinzugefügt wurden, wählen Sie oben rechts (keine) als passive Referenz aus
Dropdown-Menü ( Abbildung 7 ).
Abbildung 7. Wählen Sie Passive Referenz
Die passive Referenz sollte wie oben beschrieben auf „(keine)“ gesetzt werden.

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13) Klicken Sie auf Weiter am unteren Rande der Select - Detektoren Fenster zur fortzufahren Set Up Probenplatte
Fenster ( Abbildung 8 ).
14) Wählen Sie im Fenster " Probenplatte einrichten" ( Abbildung 8 ) mit der Maus die untere Zeile A aus
Teil des Fensters in der Tabelle (siehe Abbildung 8 ).
15) Wählen Sie im oberen Bereich des Fensters den Detektor N1 aus . Neben dem Detektor wird ein Häkchen angezeigt
Sie haben ausgewählt ( Abbildung 8 ). Sie werden auch feststellen, dass die Zeile in der Tabelle ausgefüllt wird
mit einem farbigen „U“ -Symbol, um anzuzeigen, welchen Detektor Sie ausgewählt haben.
16) Wiederholen Sie die Schritte 14 bis 15 für jeden Detektor, der im Assay verwendet wird.
Abbildung 8. Aufbau der Probenplatte
17) Wählen Sie Fertig stellen, nachdem die Detektoren ihren jeweiligen Zeilen zugewiesen wurden. ( Abbildung 9 ).
Abbildung 9. Aufbau der fertigen Platte

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18) Nach dem Klicken auf „Fertig stellen“ wird eine kurze Pause eingelegt, in der Applied Biosystems 7500 Fast Dx aktiviert wird
zu initialisieren. Auf diese Initialisierung folgt ein Klickgeräusch. Hinweis: Die Maschine muss gedreht werden
Ein für die Initialisierung.
19) Nach der Initialisierung wird die Registerkarte Platte des Setups ( Abbildung 10) angezeigt.
20) Jede Vertiefung der Platte sollte farbige U-Symbole enthalten, die den Detektoretiketten entsprechen
das wurden vorher gewählt. Um die Detektorzuweisungen zu bestätigen, wählen Sie Extras aus dem Dateimenü.
Wählen Sie dann Detector Manager.
Abbildung 10. Fenster zum Einrichten der Platte

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Gültig ab: 13.07.2020
21) Das Detektor-Manager-Fenster wird angezeigt ( Abbildung 11 ).
Abbildung 11. Detektor-Manager-Fenster
22) Vergewissern Sie sich, dass alle Detektoren enthalten sind und dass für jedes Ziel ein Reporter auf FAM und das eingestellt ist
Quencher ist auf (keine) gesetzt .
23) Wenn alle Detektoren vorhanden sind, wählen Sie Fertig . Die Detektorinformationen wurden erstellt und
Vertiefungen auf der Platte zugeordnet.
Geräteeinstellungen definieren
1) Nachdem die Detektoren erstellt und zugewiesen wurden, fahren Sie mit der Einrichtung des Instruments fort.
2) Wählen Sie die Registerkarte Instrument , um die Temperaturwechselbedingungen zu definieren.
3) Ändern Sie die Temperaturwechselbedingungen wie folgt ( Abbildung 12 ):
Thermofisher TaqPath ™ 1-Schritt RT-qPCR Master Mix, CG
ein. In Stufe 1 auf 2 min bei 25 ° C einstellen ; 1 Rep .
b. In Stufe 2 auf 15 min bei 50 ° C einstellen ; 1 Rep .
c. In Stufe 3 auf 2 min bei 95 ° C einstellen, 1 Wiederholung.
d. In Stufe 4 wurde Schritt 1 bei 95 ° C auf 3 Sekunden eingestellt .
e. In Stufe 4 wurde Schritt 2 bei 55,0 ° C auf 30 Sekunden eingestellt .
f. In Stufe 4 sollten die Wiederholungen auf 45 eingestellt sein.
G. Ändern Sie unter Einstellungen ( Abbildung 12 ) unten links das Volumen auf 20 µL.
h. Unter Einstellungen , Run - Modus sollte Auswahl seine Standard - 7500 .
ich. Schritt 2 von Stufe 4 sollte gelb hervorgehoben werden, um die Datenerfassung anzuzeigen (siehe Abbildung)
12 ).
ODER

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Quantabio qScript TM XLT Einstufiger RT-qPCR ToughMix oder UltraPlex 1-Schritt ToughMix (4X)
ein. In Stufe 1 auf 10 min bei 50 ° C einstellen ; 1 Rep .
b. In Stufe 2 auf 3 min bei 95 ° C einstellen, 1 Wiederholung.
c. In Stufe 3 wurde Schritt 1 bei 95 ° C auf 3 Sekunden eingestellt .
d. In Stufe 3 wurde Schritt 2 bei 55,0 ° C auf 30 Sekunden eingestellt .
e. In Stufe 3 sollten die Wiederholungen auf 45 eingestellt sein.
f. Ändern Sie unter Einstellungen ( Abbildung 12 ) unten links das Volumen auf 20 µL.
G. Unter Einstellungen , Run - Modus sollte Auswahl seine Standard - 7500 .
h. Schritt 2 von Stufe 3 sollte gelb hervorgehoben werden, um die Datenerfassung anzuzeigen (siehe Abbildung)
12 ).
ODER
Promega GoTaq® Probe 1-Schritt RT-qPCR-System
ein. In Stufe 1 auf 15 min bei 45 ° C einstellen ; 1 Rep .
b. In Stufe 2 auf 2 min bei 95 ° C einstellen, 1 Wiederholung.
c. In Stufe 3 wurde Schritt 1 bei 95 ° C auf 3 Sekunden eingestellt .
d. In Stufe 3 wurde Schritt 2 bei 55,0 ° C auf 30 Sekunden eingestellt .
e. In Stufe 3 sollten die Wiederholungen auf 45 eingestellt sein.
f. Ändern Sie unter Einstellungen ( Abbildung 12 ) unten links das Volumen auf 20 µL.
G. Unter Einstellungen , Run - Modus sollte Auswahl seine Standard - 7500 .
h. Schritt 2 von Stufe 3 sollte gelb hervorgehoben werden, um die Datenerfassung anzuzeigen (siehe Abbildung)
12 ).

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Abbildung 12. Instrumentenfenster
4) Nachdem Sie Änderungen an der Registerkarte Instrument vorgenommen haben , kann die Vorlagendatei gespeichert werden. Um die Vorlage zu speichern,
Wählen Sie im oberen Menü Datei und dann Speichern unter . Da die Enzymoptionen unterschiedliche Instrumente haben
In den Einstellungen wird empfohlen, die Vorlage unter einem Namen zu speichern, der die Enzymoption angibt.
5) Speichern Sie die Vorlage als 2019-nCoV Dx Panel TaqPath oder 2019-nCoV Dx Panel Quanta oder 2019-nCoV Dx
Panel Promega entsprechend im Desktop-Ordner mit der Bezeichnung " ABI Run Templates " ( Sie müssen dies erstellen
Ordner ). Als Typ speichern sollten SDB-Vorlagen (* .sdt) sein ( Abbildung 13 ).
Abbildung 13. Vorlage speichern

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Ausführen eines Tests
1) Schalten Sie das ABI 7500 Fast Dx Echtzeit-PCR-Instrument ein.
2) Starten Sie das Echtzeit-PCR-System Applied Biosystems 7500 Fast Dx durch Doppelklick auf
7500 Fast Dx System-Symbol auf dem Desktop.
3) Es sollte ein neues Fenster angezeigt werden. Wählen Sie im Menü die Option Vorhandenes Dokument öffnen .
4) Navigieren Sie zum Desktop, um Ihren ABI Run Template-Ordner auszuwählen.
5) Doppelklicken Sie auf die entsprechende Vorlagendatei ( 2019-nCoV Dx Panel TaqPath oder 2019-nCoV Dx)
Panel Quanta oder 2019-nCoV Dx Panel Promega)
6) Es wird eine kurze Pause geben, die die Fast Dx-Echtzeit-PCR von Applied Biosystems 7500 ermöglicht
Instrument zum Initialisieren. Auf diese Initialisierung folgt ein Klickgeräusch. Hinweis: Die Maschine muss
zur Initialisierung eingeschaltet sein.
Abbildung 14. Fenster zum Einrichten der Platte
7) Nach der Initialisierung des Instruments wird eine Plattenkarte angezeigt ( Abbildung 14 ). Die Detektoren und Steuerungen
sollte bereits so gekennzeichnet sein, wie sie in der Originalvorlage zugewiesen wurden.

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8) Klicken Sie im oberen Menü auf das Symbol Well Inspector .
9) Markieren Sie interessierende Probenvertiefungen auf der Plattenkarte.
10) Geben Sie die Probenkennungen in das Feld Probenname im Fenster Well Inspector ein ( Abbildung 15 ).
Abbildung 15. Beschriftungsbrunnen
11) Wiederholen Sie die Schritte 9 bis 10, bis alle Probenkennungen zum Plattenaufbau hinzugefügt wurden.

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12) Wenn alle Muster und Steuerelementbezeichner klicken Sie auf die hinzugefügt Schließen - Taste auf dem Well - Inspektor
Fenster zum zurückzukehren Platte Register Einstellung.
13) Klicken Sie oben links auf die Registerkarte Instrument .
14) Die Reaktionsbedingungen, Volumina und Art der 7500-Reaktion sollten bereits geladen sein ( Abbildung
16 ).
Abbildung 16. Geräteeinstellungen
15) Stellen Sie sicher, dass die Einstellungen korrekt sind (siehe Definieren der Geräteeinstellungen ).
16) Bevor Sie fortfahren, muss die Ausführungsdatei gespeichert werden. Wählen Sie im Hauptmenü Datei und dann Speichern unter .
Speichern Sie in der entsprechenden Bezeichnung des Ausführungsordners.
17) Laden Sie die Platte in den Plattenhalter im Instrument. Stellen Sie sicher, dass die Platte richtig ausgerichtet ist
im Halter.
18) Klicken Sie nach dem Speichern der ausgeführten Datei auf die Schaltfläche Start . Hinweis: Der Lauf sollte ungefähr 1 Stunde dauern
und 20 Minuten zu vervollständigen.

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Datenanalyse
1) Wählen Sie nach Abschluss des Laufs die Registerkarte Ergebnisse in der oberen linken Ecke der Software.
2) Wählen Sie die Registerkarte Amplification Plot , um die Rohdaten anzuzeigen ( Abbildung 17 ).
Abbildung 17. Amplifikationsdiagrammfenster
3) Markieren Sie zunächst alle Proben aus dem Lauf. Klicken Sie dazu auf das obere linke Feld (a).
der Probenvertiefungen ( Abbildung 17 ). Alle Wachstumskurven sollten in der Grafik erscheinen.
4) Auf der rechten Seite des Fensters (b) sollte die Dropdown-Auswahl Daten auf Delta eingestellt sein
Rn vs. Cycle .
5) Wählen Sie N1 aus (c) , dem Dropdown-Menü Detektor , mit dem Abwärtspfeil.
ein. Bitte beachten Sie, dass jeder Detektor einzeln analysiert wird, um unterschiedliche Reflexionen zu erzielen
Leistungsprofile jedes Primer- und Sondensatzes.
6) In der Dropdown- Liste Linienfarbe (d) sollte Detektorfarbe ausgewählt werden.
7) Wählen Sie unter Analyseeinstellungen die Option Manuelles Ct (e) .
b. Ändern Sie nicht die Standardnummern für die manuelle Basislinie .
8) Klicken und ziehen Sie mit der Maus auf die rote Schwellenwertlinie, bis sie innerhalb der Exponentialphase liegt
der Fluoreszenzkurven und über jedem Hintergrundsignal ( Abbildung 18) .
c
c
ein
b
c
d
e

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Abbildung 18. Amplifikationsdiagramm
9) Klicken Sie auf die Schaltfläche Analysieren in der unteren rechten Ecke des Fensters. Die rote Schwellenwertlinie wird gedreht
auf grün, um anzuzeigen, dass die Daten analysiert wurden.
10) Wiederholen Sie die Schritte 5 bis 9, um die für jeden Satz von Markern (N1, N2, RP) generierten Ergebnisse zu analysieren.
11) Speichern Sie die Analysedatei, indem Sie im Hauptmenü Datei und dann Speichern unter auswählen .
12) Wählen Sie nach Abschluss der Analyse für jeden der Marker die Registerkarte Bericht über dem Diagramm an
Zeigen Sie die Ct-Werte an ( Abbildung 19 ). Filtern des Berichts nach Probennamen in aufsteigender oder absteigender Reihenfolge
Um zu bestellen, klicken Sie einfach in der Tabelle auf Probenname .
Abbildung 19. Bericht
Exponentiell
PCR-Phase
Hintergrundgeräusche
Schwellenwert angepasst
in die fallen
PCR exponentiell
Phase.

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Interpretation der Ergebnisse und Berichterstattung
Extraktions- und Positivkontrollergebnisse und Interpretation
Keine Vorlagensteuerung (NTC)
Das NTC besteht aus der Verwendung von Nuklease-freiem Wasser in den rRT-PCR-Reaktionen anstelle von RNA. Der NTC
Reaktionen für alle Primer- und Sondensätze sollten keine Fluoreszenzwachstumskurven aufweisen, die die
Schwellenwertlinie. Wenn eine der NTC-Reaktionen eine Wachstumskurve aufweist, die die Zyklusschwelle überschreitet, Probe
Möglicherweise ist eine Kontamination aufgetreten. Machen Sie den Lauf ungültig und wiederholen Sie den Assay unter strikter Einhaltung der
Richtlinien.
Positive Kontrolle 2019-nCoV (nCoVPC)
Das nCoVPC besteht aus in vitro transkribierter RNA. Der nCoVPC liefert mit dem ein positives Ergebnis
folgende Primer- und Sondensätze: N1, N2 und RP.
Human Specimen Control (HSC) (Extraktionskontrolle)
Wenn HSC mit dem CDC 2019-nCoV rRT-PCR-Diagnosefeld ausgeführt wird (siehe vorherigen Abschnitt zum Assay-Set
Up) wird das HSC als Verfahrenskontrolle für die Nukleinsäureextraktion verwendet, um eine erfolgreiche Gewinnung zu demonstrieren
der Nukleinsäure sowie der Integrität des Extraktionsreagenzes. Die HSC-Kontrolle besteht aus nicht infektiöser Kultur
Material der menschlichen Zelle (A549). Gereinigte Nukleinsäure aus dem HSC sollte mit dem RP ein positives Ergebnis liefern
Primer- und Sondensatz und negative Ergebnisse mit allen 2019-nCoV-Markern.
Erwartete Leistung der im CDC 2019-nCoV-Echtzeit-RT-PCR-Diagnosepanel enthaltenen Kontrollen
Steuerung
Art
Extern
Steuerung
Name
Gewöhnt an
Monitor
2019
nCoV_N1
2019
nCoV_N2
RP
Erwartete Ct
Werte
Positiv
nCoVPC
Wesentlich
Reagenzienversagen
einschließlich
Grundierung und
Integrität der Sonde
+
+
+
<40,00 Ct
Negativ
NTC
Reagenz und / oder
Umwelt
Kontamination
- -
- -
- -
Keiner
erkannt
Extraktion
HSC
Versagen der Lyse
und Extraktion
Verfahren,
Potenzial
Kontamination
während
Extraktion
- -
- -
+
<40,00 Ct

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Wenn eine der obigen Kontrollen nicht die erwartete Leistung wie beschrieben zeigt, kann der Assay haben
wurde nicht ordnungsgemäß eingerichtet und / oder ausgeführt, oder es kann zu einer Fehlfunktion des Reagenzes oder der Ausrüstung gekommen sein.
Machen Sie den Lauf ungültig und testen Sie ihn erneut.
RNase P (Extraktionskontrolle)
➢ Alle klinischen Proben sollten Fluoreszenzwachstumskurven in der sich kreuzenden RNase P-Reaktion aufweisen
die Schwellenwertlinie innerhalb von 40,00 Zyklen (<40,00 Ct), was auf die Anwesenheit des Menschen hinweist
RNase P-Gen. Wenn RNase P in keiner klinischen Probe nachgewiesen wird, kann dies Folgendes anzeigen:
- Unsachgemäße Extraktion von Nukleinsäure aus klinischen Materialien, was zum Verlust von RNA und / oder führt
RNA-Abbau.
- Fehlen von ausreichend menschlichem Zellmaterial aufgrund schlechter Entnahme oder Verlust der Probe
Integrität.
- Unsachgemäße Einrichtung und Ausführung des Assays.
- Fehlfunktion des Reagenzes oder der Ausrüstung.
➢ Wenn der RP-Assay für klinische Proben am Menschen kein positives Ergebnis liefert, interpretieren Sie als
folgt:
- Wenn die 2019-nCoV N1 und N2 auch ohne positive RP positiv sind, ist das Ergebnis
sollte als gültig angesehen werden. Es ist möglich, dass einige Proben keine RNase P aufweisen
Wachstumskurven aufgrund niedriger Zellzahlen in der ursprünglichen klinischen Probe. Ein negatives RP-Signal
schließt das Vorhandensein von 2019-nCoV-Virus-RNA in einer klinischen Probe nicht aus.
- Wenn alle 2019-nCoV-Marker UND RNase P für die Probe negativ sind, sollte das Ergebnis sein
für die Probe als ungültig angesehen. Wenn Restproben verfügbar sind, wiederholen Sie die Extraktion
Verfahren und wiederholen Sie den Test. Wenn alle Marker nach dem erneuten Test negativ bleiben, melden Sie die
Ergebnisse als ungültig und eine neue Probe sollte nach Möglichkeit gesammelt werden .
2019-nCoV-Marker (N1 und N2)
• Wenn alle Kontrollen die erwartete Leistung aufweisen, wird eine Probe als negativ angesehen, wenn alle
Die Schwellenwertwachstumskurven für den Zyklus 2019-nCoV-Marker (N1, N2) überschreiten NICHT die Schwellenwertlinie
innerhalb von 40,00 Zyklen (<40,00 Ct) UND die RNase P-Wachstumskurve überschreitet die Schwellenwertlinie
innerhalb von 40,00 Zyklen (<40,00 Ct).
• Wenn alle Kontrollen die erwartete Leistung aufweisen, wird eine Probe für 2019- als positiv angesehen.
nCoV, wenn alle Schwellenwertwachstumskurven des Zyklus 2019-nCoV-Marker (N1, N2) die Schwellenwertlinie überschreiten
innerhalb von 40,00 Zyklen (<40,00 Ct). Die RNase P kann wie oben beschrieben positiv sein oder nicht, aber
Das Ergebnis 2019-nCoV ist weiterhin gültig.
• Wenn alle Kontrollen die erwartete Leistung und die Wachstumskurven für den 2019-nCoV aufweisen
Marker (N1, N2) UND der RNase P-Marker überschreiten NICHT die Wachstumskurve der Zyklusschwelle innerhalb
40.00 Zyklen (<40.00 Ct) ist das Ergebnis ungültig. Die aus der Probe extrahierte RNA sollte erneut entnommen werden
geprüft. Wenn keine restliche RNA verfügbar ist, extrahieren Sie die RNA erneut aus der verbleibenden Probe und testen Sie sie erneut. Wenn die
Die erneut getestete Probe ist für alle Marker und RNase P negativ, das Ergebnis ist ungültig und die Sammlung von a
Eine neue Probe des Patienten sollte in Betracht gezogen werden.
• Wenn alle Steuerelemente für alle die erwartete Leistung und die Wachstumskurve für die Zyklusschwelle aufweisen
Ein Marker (N1 oder N2, aber nicht beide Marker) überschreitet die Schwellenwertlinie innerhalb von 40,00 Zyklen (<)
40,00 Ct) das Ergebnis ist nicht schlüssig. Die extrahierte RNA sollte erneut getestet werden. Wenn restliche RNA nicht ist
verfügbar, extrahieren Sie die RNA erneut aus der Restprobe und testen Sie sie erneut. Wenn das gleiche Ergebnis erzielt wird,

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das nicht eindeutige Ergebnis melden. Wenden Sie sich an Ihr staatliches Gesundheitslabor oder CDC, as
angemessen, um eine Anleitung anzufordern und / oder die Übertragung der Probe für zusätzliche zu koordinieren
Analyse.
• Wenn HSC positiv für N1 oder N2 ist, kann während der Extraktion oder Kontamination eine Kontamination aufgetreten sein
Probenverarbeitung. Alle Ergebnisse für Proben ungültig machen, die neben dem HSC extrahiert wurden. Erneut extrahieren
Proben und HSC und erneuter Test.
Interpretationshandbuch für die Ergebnisse des 2019-nCoV rRT-PCR-Diagnosepanels
In der folgenden Tabelle sind die erwarteten Ergebnisse für das 2019-nCoV rRT-PCR-Diagnosepanel aufgeführt. Wenn ein Labor
Erhält unerwartete Ergebnisse für Assay-Kontrollen oder wenn nicht eindeutige oder ungültige Ergebnisse erhalten werden und nicht
Um durch die empfohlenen erneuten Tests gelöst zu werden, wenden Sie sich bitte an CDC, um eine Beratung zu erhalten
Überweisung von Proben. Auf den Seiten 13 und 50 finden Sie Empfehlungen und Kontaktinformationen.
2019
nCoV_N1
2019
nCoV_N2
RP
Ergebnis
Interpretation a
Bericht
Aktionen
+
+
±
2019-nCoV
erkannt
Positiv 2019-nCoV
Melden Sie die Ergebnisse an CDC und
Absender.
Wenn nur einer der beiden
Ziele ist positiv
±
Nicht schlüssig
Ergebnis
Nicht schlüssig
Wiederholen Sie den Test der Nukleinsäure
und / oder erneut extrahieren und wiederholen
rRT-PCR. Ist das wiederholte Ergebnis
bleibt nicht schlüssig, Kontakt
Ihre staatliche öffentliche Gesundheit
Labor oder CDC für
Anweisungen zur Übertragung der
Probe oder weitere Anleitung.
- -
- -
+
2019-nCoV nicht
erkannt
Nicht erkannt
Ergebnisse an Absender melden.
Erwägen Sie, für andere zu testen
Atemwegsviren. b
- -
- -
- -
Ungültiges Ergebnis
Ungültig
Wiederholen Sie die Extraktion und die rRT-PCR.
Wenn das wiederholte Ergebnis erhalten bleibt
ungültig, erwägen Sie das Sammeln von a
neue Probe vom Patienten.
a Laboratorien sollten ihr Diagnoseergebnis angemessen und in Übereinstimmung mit ihrer spezifischen Berichterstattung melden
System.
b Optimale Probentypen und ein optimaler Zeitpunkt für Spitzenvirusspiegel bei Infektionen durch 2019-nCoV wurden nicht ermittelt
entschlossen. Zum Nachweis des Virus kann die Entnahme mehrerer Proben desselben Patienten erforderlich sein. Das
Die Möglichkeit eines falsch negativen Ergebnisses sollte insbesondere in Betracht gezogen werden, wenn der Patient kürzlich exponiert oder klinisch ist
Die Präsentation legt nahe, dass eine Infektion mit 2019-nCoV möglich ist, und diagnostische Tests für andere Krankheitsursachen (z.
andere Atemwegserkrankungen) sind negativ. Wenn der Verdacht auf eine Infektion mit 2019-nCoV weiterhin besteht, sollte ein erneuter Test in Betracht gezogen werden
in Absprache mit den Gesundheitsbehörden.

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Qualitätskontrolle
• Qualitätskontrollanforderungen müssen in Übereinstimmung mit den örtlichen, staatlichen und bundesstaatlichen Vorschriften durchgeführt werden
Vorschriften oder Akkreditierungsanforderungen und die Standardqualitätskontrolle des Anwenderlabors
Verfahren. Weitere Hinweise zu geeigneten Qualitätskontrollpraktiken finden Sie in 42 CFR
493,1256.
• Qualitätskontrollverfahren sollen die Leistung von Reagenzien und Assays überwachen.
• Testen Sie alle Positivkontrollen, bevor Sie mit jeder neuen Kit-Charge Diagnoseproben durchführen, um sicherzustellen, dass alle
Reagenzien und Kit-Komponenten funktionieren ordnungsgemäß.
• Gute Laborpraxis (cGLP) empfiehlt, jeweils eine positive Extraktionskontrolle einzuschließen
Nukleinsäureisolationsansatz.
• Obwohl HSC nicht im 2019-nCov rRT-PCR-Diagnosepanel enthalten ist, wird die HSC-Extraktion durchgeführt
Die Kontrolle muss durch Nukleinsäureisolierung pro Charge der zu testenden Proben erfolgen.
• Schließen Sie immer eine negative Template-Kontrolle (NTC) und die entsprechende positive Kontrolle (nCoVPC) ein.
in jedem Amplifikations- und Detektionslauf. Alle klinischen Proben sollten auf humane RNase P getestet werden
Gen zur Kontrolle der Probenqualität und -extraktion.
Einschränkungen
• Alle Benutzer, Analysten und Personen, die Diagnoseergebnisse melden, sollten dafür geschult werden
Verfahren durch einen kompetenten Ausbilder. Sie sollten ihre Fähigkeit zur Durchführung des Tests nachweisen
und interpretieren Sie die Ergebnisse, bevor Sie den Assay unabhängig durchführen.
• Die Leistung des Echtzeit-RT-PCR-Diagnose-Panels CDC 2019-nCoV wurde nur ermittelt
in Proben der oberen und unteren Atemwege (wie Nasopharynx- oder Oropharynxabstriche)
Sputum, Aspirate der unteren Atemwege, bronchoalveoläre Lavage und Nasopharyngeal
waschen / aspirieren oder nasal aspirieren).
• Negative Ergebnisse schließen eine Infektion mit 2019-nCoV nicht aus und sollten nicht als alleinige Grundlage verwendet werden
für die Behandlung oder andere Entscheidungen des Patientenmanagements. Optimale Probentypen und Timing für
Spitzenvirusspiegel bei Infektionen durch 2019-nCoV wurden nicht bestimmt. Sammlung von
Zum Nachweis können mehrere Proben (Typen und Zeitpunkte) desselben Patienten erforderlich sein
das Virus.
• Ein falsch negatives Ergebnis kann auftreten, wenn eine Probe nicht ordnungsgemäß entnommen, transportiert oder gehandhabt wird.
Falsch-negative Ergebnisse können auch auftreten, wenn Amplifikationsinhibitoren in der Probe vorhanden sind oder wenn
In der Probe ist eine unzureichende Anzahl von Organismen vorhanden.
• Positive und negative Vorhersagewerte hängen stark von der Prävalenz ab. Falsch-negativer Test
Ergebnisse sind wahrscheinlicher, wenn die Prävalenz der Krankheit hoch ist. Falsch positive Testergebnisse sind mehr
wahrscheinlich, wenn die Prävalenz moderat bis niedrig ist.
• Verwenden Sie kein Reagenz nach dem Verfallsdatum.
• Wenn das Virus in der rRT-PCR-Zielregion mutiert, wird 2019-nCoV möglicherweise nicht oder nicht nachgewiesen
weniger vorhersehbar erkannt. Inhibitoren oder andere Arten von Interferenzen können falsch negativ sein
Ergebnis. Eine Interferenzstudie zur Bewertung der Wirkung von Erkältungsmedikamenten wurde nicht durchgeführt
durchgeführt.
• Die Testleistung kann aufgrund der Epidemiologie und des klinischen Infektionsspektrums beeinträchtigt werden
verursacht durch 2019-nCoV ist nicht vollständig bekannt. Zum Beispiel können Kliniker und Labors nicht wissen

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die optimalen Arten von Proben zu sammeln, und im Verlauf der Infektion, wenn diese
Proben enthalten höchstwahrscheinlich Mengen an viraler RNA, die leicht nachgewiesen werden können.
• Der Nachweis von viraler RNA weist möglicherweise nicht auf das Vorhandensein eines infektiösen Virus hin oder darauf, dass 2019-nCoV das ist
Erreger für klinische Symptome.
• Die Durchführung dieses Tests wurde für die Überwachung der Behandlung von 2019-nCoV nicht nachgewiesen
Infektion.
• Die Durchführung dieses Tests wurde für das Screening von Blut oder Blutprodukten nicht nachgewiesen
für die Anwesenheit von 2019-nCoV.
• Dieser Test kann Krankheiten, die durch andere bakterielle oder virale Krankheitserreger verursacht werden, nicht ausschließen.
Zulassungsbedingungen für das Labor
Das Autorisierungsschreiben des CDC 2019-nCoV-Echtzeit-RT-PCR-Diagnosepanels zusammen mit dem
autorisiertes Fact Sheet für Gesundheitsdienstleister, autorisiertes Fact Sheet für Patienten und autorisiert
Die Kennzeichnung ist auf der FDA-Website verfügbar:
https://www.fda.gov/MedicalDevices/Safety/EmergencySituations/ucm161496.htm
Die Verwendung des Echtzeit-RT-PCR-Diagnosepanels CDC 2019-nCoV muss den in beschriebenen Verfahren folgen
die Gebrauchsanweisung dieses Herstellers und die im Schreiben vom
Genehmigung. Abweichungen von den beschriebenen Verfahren sind im Notfall nicht zulässig
Genehmigung (EUA). Unterstützung klinischer Labors bei der Durchführung der CDC 2019-nCoV-Echtzeit-RT-PCR
Diagnostic Panel, die relevanten Zulassungsbedingungen sind nachstehend wörtlich aufgeführt und müssen
von Laboratorien, die den EUA-Test durchführen, erfüllt werden.
• Autorisierte Laboratorien 1 enthalten Berichte über die Ergebnisse der CDC 2019-nCoV Real-Time
RT-PCR Diagnostic Panel, alle autorisierten Fact Sheets. Unter dringenden Umständen andere
Es können geeignete Methoden zur Verbreitung dieser Informationsblätter verwendet werden, die auch Masse umfassen können
Medien.
• Autorisierte Labors führen das CDC 2019-nCoV-Echtzeit-RT-PCR-Diagnosepanel als durch
beschrieben im Echtzeit-RT-PCR-Diagnose-Panel des CDC 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV)
Gebrauchsanweisung. Abweichungen von den zugelassenen Verfahren, einschließlich der zugelassenen RT-PCR
Instrumente, zugelassene Extraktionsmethoden, zugelassene klinische Probentypen, zugelassen
Kontrollmaterialien, zugelassene andere Hilfsreagenzien und zugelassene Materialien, die erforderlich sind
Durchführung des CDC 2019-nCoV Echtzeit-RT-PCR-Diagnose-Panels sind nicht zulässig. 2
• Autorisierte Labors, die das CDC 2019-nCoV-Echtzeit-RT-PCR-Diagnosepanel erhalten, müssen
Informieren Sie die zuständigen Gesundheitsbehörden über ihre Absicht, den Test vor Beginn durchzuführen
testen.
1 Autorisierte Laboratorien: Zur Vereinfachung der Bezugnahme bezieht sich das Autorisierungsschreiben auf „Laboratorien, die gemäß der Klinik zertifiziert sind
Laborverbesserungsänderungen von 1988 (CLIA), 42 USC § 263a, zur Durchführung von Tests mit hoher Komplexität “als„ genehmigt “
Laboratorien. "
2 Wenn ein autorisiertes Labor daran interessiert ist, Änderungen am Echtzeit-RT-PCR-Diagnosepanel CDC 2019-nCoV vorzunehmen
die nicht in den Geltungsbereich (Abschnitt II) dieses Zulassungsschreibens fallen Die FDA empfiehlt, dass Sie dies nach Prüfung mit der FDA besprechen
die Richtlinie, die unter Sofort in der Wirkungsanleitung für klinische Laboratorien und Mitarbeiter der Lebensmittel- und Arzneimittelverwaltung beschrieben ist: Richtlinie
für Diagnosetests in Labors, die für die Durchführung von Hochkomplexitätstests unter CLIA vor dem Notfall zertifiziert sind
Zulassung für Coronavirus Disease-2019 während des Notfalls im Bereich der öffentlichen Gesundheit
(https://www.fda.gov/media/135659/download).

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• Autorisierte Labors verfügen über ein Verfahren zur Meldung von Testergebnissen an das Gesundheitswesen
gegebenenfalls Anbieter und zuständige Gesundheitsbehörden.
• Autorisierte Laboratorien sammeln Informationen über die Durchführung des Tests und berichten an
DMD / OHT7-OIR / OPEQ / CDRH (per E-Mail: CDRH-EUA-Reporting@fda.hhs.gov) und CDC
( respvirus@cdc.gov ) jedes vermutete Auftreten falsch positiver oder falsch negativer Ergebnisse und
signifikante Abweichungen von den festgelegten Leistungsmerkmalen des Tests, von dem sie
bewusst werden.
• Autorisierte Laboratorien melden unerwünschte Ereignisse, einschließlich Probleme mit der Testleistung oder
Ergebnisse an MedWatch durch Übermittlung des Online-FDA-Formulars 3500
(https://www.accessdata.fda.gov/scripts/medwatch/index.cfm?action=reporting.home) oder von
Rufen Sie 1-800-FDA-1088 an
• Das gesamte Laborpersonal, das den Test verwendet, muss in RT-PCR-Techniken und geschult sein
Verwenden Sie beim Umgang mit diesem Kit und bei der Verwendung geeignete Labor- und persönliche Schutzausrüstung
die Prüfung gemäß der zugelassenen Kennzeichnung.
• CDC, IRR, Hersteller und Vertreiber von kommerziellen Materialien, die auf der EU als akzeptabel identifiziert wurden
Die CDC-Website und autorisierte Laboratorien stellen sicher, dass alle mit dieser EUA verbundenen Aufzeichnungen vorliegen
werden beibehalten, bis die FDA etwas anderes mitteilt. Solche Aufzeichnungen werden der FDA für zur Verfügung gestellt
Inspektion auf Anfrage.
Leistungsmerkmale
Analytische Leistung:
Nachweisgrenze (LoD):
LoD-Studien bestimmen die niedrigste nachweisbare Konzentration von 2019-nCoV, bei der ungefähr 95%
von allen (wahr positiv) Wiederholungen Test positiv. Die LoD wurde durch Grenzverdünnungsstudien unter Verwendung bestimmt
charakterisierte Proben.
Die analytische Empfindlichkeit der im CDC 2019 Novel Coronavirus (2019-) enthaltenen rRT-PCR-Assays
nCoV) Das Echtzeit-RT-PCR-Diagnosepanel wurde in Studien zur Nachweisgrenze bestimmt. Da nein
Derzeit sind quantifizierte Virusisolate des 2019-nCoV verfügbar, Assays zum Nachweis des
2019-nCoV-RNA wurde mit charakterisierten Beständen an in vitro transkribierter RNA voller Länge (N-Gen;
GenBank-Zugang: MN908947.2) des bekannten Titers (RNA-Kopien / µL), versetzt in ein Verdünnungsmittel bestehend aus a
Suspension von humanen A549-Zellen und viralem Transportmedium (VTM) zur Nachahmung der klinischen Probe. Proben
wurden unter Verwendung des QIAGEN EZ1 Advanced XL-Instruments und des EZ1 DSP-Virus-Kits (Kat. Nr. 62724) extrahiert und
manuell mit dem QIAGEN DSP Viral RNA Mini Kit (Kat. Nr. 61904). Echtzeit-RT-PCR-Assays waren
durchgeführt mit dem 1-Schritt-RT-qPCR-Master-Mix von ThemoFisher Scientific TaqPath ™, CG (Kat.-Nr. A15299)
das Applied Biosystems ™ 7500 Fast Dx-Echtzeit-PCR-Instrument gemäß CDC 2019-nCoV Real-
Gebrauchsanweisung des Time RT-PCR Diagnostic Panel.

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Eine vorläufige LoD für jeden Assay wurde bestimmt, indem dreifache Proben von RNA getestet wurden, die unter Verwendung von jedem gereinigt wurden
Extraktionsmethode. Die ungefähre LoD wurde durch Extrahieren und Testen von 10-fachen Reihenverdünnungen identifiziert
von charakterisierten Beständen von in vitro transkribierter RNA voller Länge. Eine Bestätigung des LoD wurde ermittelt
unter Verwendung von 3-fach seriellen Verdünnungs-RNA-Proben mit 20 extrahierten Replikaten. Der LoD wurde als der bestimmt
niedrigste Konzentration, bei der ≥ 95% (19/20) der Replikate positiv waren.
Tabelle 4. Nachweisgrenze Bestätigung des CDC 2019-nCoV-Echtzeit-RT-PCR-Diagnosefelds
mit QIAGEN EZ1 DSP
Ziele
2019-nCoV_N1
2019-nCoV_N2
RNA-Konzentration 1
10 0,5
10 0.0
10 -0,5
10 0,5
10 0.0
10 -0,5
Positiv / Gesamt
20/20 19/20 13/20 20/20 17/20 9/20
Mittlerer Ct 2
32,5 35,4 NA
35,8 NA
N / A
Standardabweichung
(Ct)
0,5
0,8
N / A
1.3
N / A
N / A
1 Die Konzentration wird in RNA-Kopien / µL angegeben
2 Der mittlere Ct wurde für Verdünnungen angegeben, die ≥ 95% positiv sind. Berechnungen beinhalten nur positive Ergebnisse.
N / a nicht anwendbar
Tabelle 5. Nachweisgrenze Bestätigung CDC 2019-nCoV Echtzeit-RT-PCR-Diagnosefeld mit
QIAGEN QIAmp DSP Virales RNA Mini Kit
Ziele
2019-nCoV_N1
2019-nCoV_N2
RNA-Konzentration 1
10 0,5
10 0.0
10 -0,5
10 0,5
10 0.0
10 -0,5
10 -1,0
Positiv / Gesamt
20/20 20/20 6/20 20/20 20/20 20/20 8/20
Mittlerer Ct 2
32,0 32,8 NA
33,0 35,4 36,2 NA
Standardabweichung
(Ct)
0,7
0,8
N / A
1.4
0,9
1.9
N / A
1 Die Konzentration wird in RNA-Kopien / µL angegeben
2 Der mittlere Ct wurde für Verdünnungen angegeben, die ≥ 95% positiv sind. Berechnungen beinhalten nur positive Ergebnisse.
N / a nicht anwendbar
Tabelle 6. Nachweisgrenze des CDC 2019-nCoV-Echtzeit-RT-PCR-Diagnosefelds
Virus
Material
Nachweisgrenze (RNA-Kopien / µl )
QIAGEN EZ1
Advanced XL
QIAGEN DSP Viral
RNA Mini Kit
2019 Roman
Coronavirus
N-Gen-RNA
Transkript
10 0,5
10 0
FDA-Sensitivitätsbewertung: Die analytische Sensitivität des Tests wird durch Bewertung einer
Von der FDA empfohlenes Referenzmaterial unter Verwendung eines von der FDA entwickelten Protokolls, falls zutreffend und / oder wann
verfügbar.

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In Silico-Analyse von Primer- und Sondensequenzen:
Die Oligonukleotid-Primer- und Sondensequenzen der CDC 2019 nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic
Das Panel wurde anhand von 31.623 Sequenzen bewertet, die in der Global Initiative on Sharing All Influenza verfügbar sind
Daten (GISAID, https://www.gisaid.org) Datenbank vom 20. Juni 2020, um die vorhergesagten zu demonstrieren
Inklusivität des Echtzeit-RT-PCR-Diagnose-Panels 2019-nCoV. Nucleotidfehlpaarungen in der
Primer / Sonden-Regionen mit Frequenzen> 0,1% sind unten gezeigt. Mit Ausnahme eines Nukleotids
Fehlanpassung mit einer Frequenz> 1% (2,00%) an der dritten Position der N1-Sonde, der Frequenz aller
Fehlpaarungen waren <1%, was darauf hinweist, dass die Prävalenz der Fehlpaarungen sporadisch war. Nur eine Sequenz
(0,0032%) hatten zwei Nukleotidfehlpaarungen in der N1-Sonde und eine andere Sequenz von einer anderen
Das Isolat (0,0032%) hatte zwei Nukleotidfehlpaarungen im N1-Reverse-Primer. Es wurden keine Sequenzen gefunden
mehr als eine Fehlpaarung in einer N2-Primer / Sondenregion aufweisen. Das Risiko dieser Fehlanpassungen führt zu
Ein signifikanter Reaktivitätsverlust, der ein falsch negatives Ergebnis verursacht, ist aufgrund des Designs des
Primer und Sonden mit Schmelztemperaturen> 60 ° C und einer Glühtemperatur von 55 ° C, die dies können
tolerieren bis zu zwei Fehlpaarungen.
Tabelle 7. In-Silico-Inklusivitätsanalyse des CDC 2019-nCoV-Echtzeit-RT-PCR-Diagnosepanels unter
31.623 Genomsequenzen sind ab dem 20. Juni 2020 bei GISAID erhältlich
Primer / Sonde
N1 Sonde
N1 rückwärts
N2-Sonde
Lage (5 '> 3')
3
fünfzehn
21
13
Fehlpaarungsnukleotid
C> T.
G> T.
T> C.
C> T.
Nicht übereinstimmende Nr.
632
34
71
46
Nichtübereinstimmungshäufigkeit (%)
2.00
0,11
0,22
0,15
Spezifitäts- / Exklusivitätstests: In der Silico-Analyse
BLASTn-Analyse-Abfragen der 2019-nCoV-rRT-PCR-Assays-Primer und -Sonden wurden gegen durchgeführt
Public-Domain-Nukleotidsequenzen. Die Datenbanksuchparameter waren wie folgt: 1) Das Nukleotid
Die Sammlung besteht aus GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + RefSeq-Sequenzen, schließt jedoch EST, STS, GSS, WGS,
TSA, Patentsequenzen sowie Phase 0-, 1- und 2-HTGS-Sequenzen und Sequenzen, die länger als 100 MB sind;
2) Die Datenbank ist nicht redundant. Währenddessen wurden identische Sequenzen zu einem Eintrag zusammengeführt
Beibehaltung der Informationen zu Beitritt, GI, Titel und Taxonomie für jeden Eintrag; 3) Datenbank wurde am aktualisiert
10/03/2019; 4) Die Suchparameter passen sich automatisch an kurze Eingabesequenzen und die Erwartung an
Schwelle ist 1000; 5) Die Übereinstimmungs- und Nichtübereinstimmungswerte betragen 1 bzw. -3; 6) Die Strafe zu erstellen
und verlängern Sie eine Lücke in einer Ausrichtung ist 5 bzw. 2.
2019-nCoV_N1-Assay:
Die Sondensequenz des 2019-nCoV-rRT-PCR-Assays N1 zeigte eine hohe Sequenzhomologie mit SARS
Coronavirus und Bat SARS-ähnliches Coronavirus-Genom. Vorwärts- und Rückwärtsprimer zeigten jedoch keine
Sequenzhomologie mit SARS-Coronavirus und Bat SARS-ähnlichem Coronavirus-Genom. Primer kombinieren
und Sonde gibt es keine signifikanten Homologien mit dem menschlichen Genom, anderen Coronaviren oder dem Menschen
Mikroflora, die potenzielle falsch positive rRT-PCR-Ergebnisse vorhersagen würde.

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2019-nCoV_N2-Assay:
Die Vorwärtsprimersequenz des 2019-nCoV-rRT-PCR-Assays N2 zeigte eine hohe Sequenzhomologie zu Bat
SARS-ähnliche Coronaviren. Die Reverse-Primer- und Sondensequenzen zeigten keine signifikante Homologie mit
menschliches Genom, andere Coronaviren oder menschliche Mikroflora. Wenn Primer und Sonde kombiniert werden, gibt es keine
Vorhersage möglicher falsch positiver rRT-PCR-Ergebnisse.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der 2019-nCoV-rRT-PCR-Assay N1 und N2 für den spezifischen Nachweis von 2019-nCoV entwickelt wurde.
zeigten keine signifikanten kombinierten Homologien mit dem menschlichen Genom, anderen Coronaviren oder dem Menschen
Mikroflora, die potenzielle falsch positive rRT-PCR-Ergebnisse vorhersagen würde.
Zusätzlich zur In-Silico- Analyse wurden mehrere Organismen extrahiert und mit dem CDC 2019-nCoV getestet
Echtzeit-RT-PCR-Diagnose-Panel zum Nachweis der analytischen Spezifität und Exklusivität. Studien waren
durchgeführt mit Nukleinsäuren, die mit dem QIAGEN EZ1 Advanced XL-Instrument und EZ1 DSP extrahiert wurden
Virus Kit. Nukleinsäuren wurden aus Präparaten mit hohem Titer (typischerweise ≥ 10 5 PFU / ml oder ≥ 10 6) extrahiert
KBE / ml). Die Tests wurden unter Verwendung des 1-Schritt-RT-qPCR-Master-Mix von ThemoFisher Scientific TaqPath ™ durchgeführt.
CG auf dem Applied Biosystems ™ 7500 Fast Dx Echtzeit-PCR-Instrument. Die Daten zeigen, dass die
Die erwarteten Ergebnisse werden für jeden Organismus erhalten, wenn sie mit der CDC 2019-nCoV-Echtzeit-RT-PCR getestet werden
Diagnose-Panel.

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Tabelle 8. Spezifität / Exklusivität des CDC 2019-nCoV-Echtzeit-RT-PCR-Diagnosepanels
Virus
Belastung
Quelle
2019-
nCoV_
N1
2019-
nCoV_
N2
Finale
Ergebnis
Menschliches Coronavirus
229E
Isolieren
0/3
0/3
Neg.
Menschliches Coronavirus
OC43
Isolieren
0/3
0/3
Neg.
Menschliches Coronavirus
NL63
klinische Probe
0/3
0/3
Neg.
Menschliches Coronavirus
HKU1
klinische Probe
0/3
0/3
Neg.
MERS-Coronavirus
Isolieren
0/3
0/3
Neg.
SARS-Coronavirus
Isolieren
0/3
0/3
Neg.
Bocavirus
- -
klinische Probe
0/3
0/3
Neg.
Mycoplasma pneumoniae
Isolieren
0/3
0/3
Neg.
Streptococcus
Isolieren
0/3
0/3
Neg.
Influenza A (H1N1)
Isolieren
0/3
0/3
Neg.
Influenza A (H3N2)
Isolieren
0/3
0/3
Neg.
Influenza B.
Isolieren
0/3
0/3
Neg.
Humanes Adenovirus, Typ 1
Ad71
Isolieren
0/3
0/3
Neg.
Humanes Metapneumovirus
- -
Isolieren
0/3
0/3
Neg.
respiratorisches Synzytial-Virus
Lang A.
Isolieren
0/3
0/3
Neg.
Rhinovirus
Isolieren
0/3
0/3
Neg.
Parainfluenza 1
C35
Isolieren
0/3
0/3
Neg.
Parainfluenza 2
Greer
Isolieren
0/3
0/3
Neg.
Parainfluenza 3
C-43
Isolieren
0/3
0/3
Neg.
Parainfluenza 4
M-25
Isolieren
0/3
0/3
Neg.
Studien zu endogenen Interferenzsubstanzen :
Das CDC 2019-nCoV-Echtzeit-RT-PCR-Diagnosepanel verwendet herkömmliche, gut etablierte Nukleinsäuren
Extraktionsmethoden und basierend auf unseren Erfahrungen mit anderen EUA-Assays von CDC, einschließlich des CDC Novel
Coronavirus 2012 Echtzeit-RT-PCR-Assay zum mutmaßlichen Nachweis von Atemwegen im Nahen Osten
Syndrom Coronavirus (MERS-CoV) und CDC Human Influenza Virus Echtzeit-RT-PCR-Diagnose
Panel-Influenza A / H7-Assay (Eurasische Linie) zum mutmaßlichen Nachweis neuartiger Influenza A (H7N9)
Viren, die beide für die Verwendung mit einer Reihe von Atemwegsproben vorgesehen sind, erwarten wir nicht
Störungen durch häufig vorkommende körpereigene Substanzen.
Probenstabilität und Frischgefriertests:
Um die Wahrscheinlichkeit des Nachweises einer Infektion zu erhöhen, empfiehlt CDC die Entnahme von unteren Atemwegen und
Proben der oberen Atemwege zum Testen. Wenn möglich, sollten zusätzliche Probentypen (z. B. Stuhl, Urin) verwendet werden
gesammelt werden und sollte zunächst gelagert werden, bis die CDC entscheidet, ob zusätzliche Proben vorhanden sind
Quellen sollten getestet werden. Die Proben sollten so bald wie möglich entnommen werden, sobald eine PUI identifiziert wurde
unabhängig vom Auftreten der Symptome. Achten Sie beim Sammeln von Proben auf eine ordnungsgemäße Infektionskontrolle. Geschäft
Proben bei 2-8 ° C und über Nacht auf Eisbeutel an CDC senden. Beschriften Sie jeden Probenbehälter mit dem
Patienten-ID-Nummer (z. B. Nummer der Krankenakte), eindeutige Proben-ID (z. B. Laboranforderung)
Anzahl), Probentyp (z. B. Nasentupfer) und Datum der Probenentnahme. Schließe eine CDC ab
Formular 50.34 für jedes eingereichte Exemplar.

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Klinische Leistung:
Bis zum 22. Februar 2020 hat CDC 2071 Atemproben von untersuchten Personen getestet
(PUI) in den USA unter Verwendung des CDC 2019-nCoV-Echtzeit-RT-PCR-Diagnose-Panels. Probentypen umfassen
Bronchialflüssigkeit / Waschung, Bukkalabstrich, Nasenspülung / Aspiration, Nasopharyngealabstrich, Nasopharyngeal / Rachen
Tupfer, Mundtupfer, Sputum, oropharyngealer (Rachen-) Tupfer, Tupfer (nicht spezifiziert) und Rachenabstrich.
Tabelle 9: Zusammenfassung der Echtzeit-RT-PCR-Diagnosepaneldaten des CDC 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV)
Erstellt durch Testen von menschlichen Atemwegsproben, die von PUI-Probanden in den USA gesammelt wurden
Probentyp
2019-nCoV
Negativ
2019-nCoV
Positiv
Nicht schlüssig
Ungültig
Gesamt
Bronchial
Flüssigkeit / waschen
2
0
0
0
2
Bukkaltupfer
5
1
0
0
6
Nasal
waschen / aspirieren
6
0
0
0
6
Nasopharyngeal
Tupfer
927
23
0
0
950
Nasopharyngeal
Tupfer / Hals
Tupfer
4
0
0
0
4
Mundtupfer
476
9
0
0
485
Rachen
(Halsabstrich
363
10
0
1
374
Sputum
165
5
0
0
170
Tupfer
(nicht spezifiziert) 1
71
1
0
0
72
Gewebe (Lunge)
2
0
0
0
2
Gesamt
2021
49
0
1
2071
1 Bei diesen Proben der oberen Atemwege fehlten tatsächliche Informationen zum Tupfertyp.
Zweitausend einundzwanzig (2021) Atemproben der 2071 getesteten Atemproben
negativ durch das CDC 2019-nCoV Echtzeit-RT-PCR-Diagnosepanel. Neunundvierzig (49) des Jahres 2071
Atemproben wurden vom CDC 2019-nCoV-Echtzeit-RT-PCR-Diagnosepanel positiv getestet. Nur
Eine Probe (oropharyngealer (Rachen-) Tupfer) war ungültig. Von den 49 getesteten Atemproben
positiv vom CDC 2019-nCoV Echtzeit-RT-PCR-Diagnose-Panel, siebzehn (17) wurden von bestätigt
genetische Sequenzierung und / oder Viruskultur (positive prozentuale Übereinstimmung = 17/17, 95% CI: 81,6% -100%)
In der frühen Phase des Tests wurden insgesamt 117 Atemproben von 46 PUI-Probanden entnommen
wurden auch mit zwei analytisch validierten Echtzeit-RT-PCR-Assays getestet, die auf separate und
unabhängige Regionen des Nucleocapsid-Protein-Gens der 2019-nCoV-, N4- und N5-Assays. Das
Nucleocapsid-Protein-Genziele für die N4- und N5-Assays sind unterschiedlich und unabhängig von den
Nucleocapsid-Protein-Genziele für die beiden RT-PCR-Assays, die in der CDC 2019-nCoV-Echtzeit enthalten sind
RT-PCR Diagnostic Panel, N1 und N2. Jedes positive Ergebnis des N4- und / oder N5-Assays war weiter
untersucht durch genetische Sequenzierung.

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Leistung des CDC 2019-nCoV Echtzeit-RT-PCR-Diagnose-Panels zum Testen dieser 117 Atemwege
Die Proben wurden gegen einen zusammengesetzten Komparator geschätzt. Eine Probe wurde als Komparator angesehen
negativ, wenn sowohl der N4- als auch der N5-Assay negativ waren. Eine Probe wurde als Komparator angesehen
positiv, wenn der N4- und / oder der N5-Assay ein positives Ergebnis erbrachte, und der Komparator positiv
Die Ergebnisse wurden weiter untersucht und durch genetische Sequenzierung als 2019-nCoV-RNA-positiv bestätigt.
Tabelle 10: Prozentuale Übereinstimmung des CDC 2019-nCoV-Echtzeit-RT-PCR-Diagnosepanels mit dem
Zusammengesetzter Komparator
CDC 2019-nCoV
Panel Ergebnis
Composite Comparator Ergebnis
Positiv
Negativ
Positiv
13 1
0
Nicht schlüssig
0
0
Negativ
0
104
1 Für 13 von 49 CDC 2019-nCoV Panel-positiven Proben lagen zusammengesetzte Komparatorergebnisse vor
nur.
Positive prozentuale Übereinstimmung = 13/13 = 100% (95% CI: 77,2% - 100%)
Negative prozentuale Übereinstimmung = 104/104 = 100% (95% CI: 96,4% - 100%)
Bewertung des Enzym-Master-Mix:
Die Grenze der Nachweisäquivalenz zwischen dem ThermoFisher TaqPath ™ 1-Schritt RT-qPCR Master Mix und
Die folgenden Enzym-Master-Mischungen wurden bewertet: Quantabio qScript XLT Einstufiger RT-qPCR ToughMix,
Quantabio UltraPlex 1-Schritt ToughMix (4X) und Promega GoTaq® Probe 1-Schritt RT-qPCR-System. Seriennummer
Verdünnungen des neuartigen Coronavirus-Transkripts (SARS CoV-2) von 2019 wurden dreifach mit der CDC 2019- getestet.
nCoV Echtzeit-RT-PCR-Diagnose-Panel unter Verwendung aller vier Enzym-Master-Mixe. Beide hergestellt
Für den Vergleich wurden Versionen der Oligonukleotidsonde BHQ und ZEN verwendet. Der niedrigste nachweisbare
Transkriptkonzentration, bei der alle Replikate mit dem Quantabio qScript XLT One- positiv getestet wurden
Schritt RT-qPCR ToughMix und Quantabio UltraPlex 1-Schritt ToughMix (4X) war ähnlich dem für
der ThemoFisher TaqPath ™ 1-Schritt RT-qPCR Master Mix. Die niedrigste nachweisbare Konzentration von
Das Transkript bei Verwendung des Promega GoTaq® Probe 1-Step RT-qPCR-Systems war eine Verdünnung darüber
beobachtet für die anderen Kandidaten, wenn sie mit der BHQ-Version der CDC-Assays bewertet werden. Das
Kandidaten-Master-Mixe werden alle gleichwertig oder mit einer Verdünnung unterhalb des ThemoFisher TaqPath ™ durchgeführt
1-Schritt RT-qPCR Master Mix bei Auswertung mit der ZEN-Version der CDC-Assays.

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Gültig ab: 13.07.2020
Tabelle 11: Vergleichsgrenze Vergleich für Enzym-Master-Mischungen - Ergebnisse der Zusammenfassung der BHQ-Sonde
Nummer kopieren
ThemoFisher TaqPath ™
1-Schritt RT-qPCR Master
Mischen
Quantabio qScript XLT
Einstufiger RT-qPCR
ToughMix
Quantabio UltraPlex 1-
Schritt ToughMix (4X)
Promega GoTaq® Sonde
1-Schritt RT-qPCR-System
2019-
nCoV_N1
2019-
nCoV_N2
2019-
nCoV_N1
2019-
nCoV_N2
2019-
nCoV_N1
2019-
nCoV_N2
2019-
nCoV_N1
2019-
nCoV_N2
10 2 Kopien / µL
3/3
3/3
3/3
3/3
3/3
3/3
3/3
3/3
10 1 Kopien / µL
3/3
3/3
3/3
3/3
3/3
3/3
3/3
3/3
10 0 Kopien / µL
3/3
3/3
3/3
3/3
3/3
3/3
3/3
2/3
10 -1 Kopien µL
2/3
0/3
1/3
1/3
1/3
1/3
0/3
0/3
Tabelle 12: Vergleichsgrenze Vergleich für Enzym-Master-Gemische - Ergebnisse der ZEN-Sondenzusammenfassung
Nummer kopieren
ThemoFisher TaqPath ™
1-Schritt RT-qPCR Master
Mischen
Quantabio qScript XLT
Einstufiger RT-qPCR
ToughMix
Quantabio UltraPlex 1-
Schritt ToughMix (4X)
Promega GoTaq® Sonde
1-Schritt RT-qPCR-System
2019-
nCoV_N1
2019-
nCoV_N2
2019-
nCoV_N1
2019-
nCoV_N2
2019-
nCoV_N1
2019-
nCoV_N2
2019-
nCoV_N1
2019-
nCoV_N2
10 2 Kopien / µL
3/3
3/3
3/3
3/3
3/3
3/3
3/3
3/3
10 1 Kopien / µL
3/3
3/3
3/3
3/3
3/3
3/3
3/3
3/3
10 0 Kopien / µL
3/3
2/3
3/3
3/3
3/3
2/3
3/3
3/3
10 -1 Kopien µL
1/3
1/3
0/3
0/3
0/3
1/3
1/3
1/3
Retrospektiv positive (18) und negative (17) klinische Atemwegsproben wurden mit dem extrahiert
Das QIAGEN EZ1 Advanced XL-Instrument und das EZ1 DSP-Virus-Kit wurden mit dem CDC 2019-nCoV getestet
Echtzeit-RT-PCR-Diagnose-Panel mit dem einstufigen RT-qPCR ToughMix von Quantabio qScript XLT,
Quantabio UltraPlex 1-Schritt ToughMix (4X) und Promega GoTaq® Probe 1-Schritt RT-qPCR System Master
mischt. Alle drei Enzym-Master-Mixe zeigten eine äquivalente Leistung und zeigten 100% positiv und 100%.
negative Übereinstimmung mit den erwarteten Ergebnissen und einem 95% -Konfidenzintervall von 82,4% -100% und 81,6% -
Jeweils 100%.
Tabelle 13: Klinischer Vergleich - Ergebnisse der retrospektiven Studienzusammenfassung
CDC 2019-nCoV
Echtzeit RT-
PCR-Diagnose
Panel Ergebnis
Quantabio qScript XLT
Einstufiger RT-qPCR
ToughMix
Quantabio UltraPlex 1-Schritt
ToughMix (4X)
Promega GoTaq® Sonde 1-
Schritt RT-qPCR-System
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
Positiv
18
0
18
0
18
0
Negativ
0
17
0
17
0
17

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Bewertung der Extraktionsplattform von Roche MagNA Pure 24 und MagNA Pure 96:
Leistung des Echtzeit-RT-PCR-Diagnose-Panels 2019-CoV mit Roche MagNA Pure 24 und
MagNA Pure 96-Extraktionsplattformen wurden mit der Leistung einer autorisierten Extraktion verglichen
Methode. Reihenverdünnungen des quantifizierten inaktivierten SARS-CoV-2-Virus (USA-WA1 / 2020; 100 RNA-Kopien / µL)
in Lysepuffer wurden zu gepoolter negativer Probenmatrix der oberen Atemwege gegeben. Fünf Proben von
Jede Verdünnung wurde parallel zum QIAGEN EZ1 Advanced XL (EZ1 DSP-Virus-Kit Cat # 62724) extrahiert.
und das Roche MagNA Pure 24 (MagNA Pure 24 Total NA Isolationskit Kat.-Nr. 07658036001) und Roche
MagNA Pure 96 (MagNA Pure 96-Kit für DNA und virale Nukleinsäure mit kleinem Volumen, Kat.-Nr. 06543588001)
Extraktionsplattformen und bewertet mit dem 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel und
ThermoFisher TaqPath ™ 1-Schritt RT-qPCR Master Mix. Die beobachtete LoD wurde als die niedrigste definiert
Konzentration, bei der 100% (5 von insgesamt 5) aller Replikate für beide Primer / Sonden-Sets positiv getestet wurden
(N1 und N2) im CDC 2019-nCoV-Echtzeit-RT-PCR-Diagnosefeld. Die Akzeptanzkriterien für
Äquivalenz wurde definiert als Nachweis einer beobachteten LoD entweder am gleichen Endpunkt oder innerhalb eines 3-
Verdünnung falten. Die Ergebnisse zeigten, dass sowohl die Extraktionsplattformen MagNA Pure 24 als auch MagNA Pure 96
äquivalent oder innerhalb einer dreifachen Verdünnung des LoD durchgeführt, die bei Verwendung des QIAGEN EZ1 beobachtet wurde
Erweiterte XL-Extraktionsplattform.
Tabelle 14. Vergleichsgrenze Vergleich zwischen dem QIAGEN EZ1 Advanced XL, Roche MagNA Pure
96 und Roche MagNA Pure 24 Extraktionsplattformen unter Verwendung der CDC 2019-nCoV-Echtzeit-RT-PCR
Diagnose-Panel
Plattform
Parameter
2019-nCoV_N1-Assay
2019-nCoV_N2-Assay
Beobachtete
LoD 1
QIAGEN EZ1
Advanced XL
RNA-Kopien / µL
10 1.0
10 0,5
10 0.0
10 1.0
10 0,5
10 0.0
10 0,5
# pos./total
5/5
5/5
5/5
5/5
5/5
3/5
Mittlerer Ct 2
34.0
35.0
36.3
33.9
36.6
N / A
Std. Abweichung
0,2
0,8
0,2
0,4
0,9
N / A
Roche MagNA Pure
96
RNA-Kopien / µL
10 1.0
10 0,5
10 0.0
10 1.0
10 0,5
10 0.0
10 0,5
# pos./total
5/5
5/5
5/5
5/5
5/5
2/5
Mittlerer Ct 2
33.3
34.6
36.1
33.2
35.7
N / A
Std. Abweichung
0,5
0,5
0,3
0,3
0,4
N / A
Roche MagNA Pure
24
RNA-Kopien / µL
10 1.0
10 0,5
10 0.0
10 1.0
10 0,5
10 0.0
10 1.0
# pos./total
5/5
3/5
3/5
5/5
5/5
5/5
Mittlerer Ct 2
34.4
N / A
N / A
35.2
36.9
36.2
Std. Abweichung
0,6
N / A
N / A
0,5
1.0
0,8
1 Die Konzentration wird in RNA-Kopien / µL angegeben. Die beobachtete LoD ist die niedrigste Konzentration, bei der beide Assays 100% zeigten
positive Erkennung.
2 Der mittlere Ct wurde für Verdünnungen angegeben, die eine 100% ige Positivität zeigen. Berechnungen beinhalten nur positive Ergebnisse.
NA = nicht anwendbar
Zuvor charakterisierte klinische Restproben (14 positiv und 15 negativ) wurden unter Verwendung von extrahiert
sowohl die Extraktionsplattformen Roche MagNA Pure 96 als auch MagNA Pure 24 und bewertet mit dem 2019-
nCoV Echtzeit-RT-PCR-Diagnosefeld und ThermoFisher TaqPath ™ 1-Schritt-RT-qPCR-Master-Mix.
Akzeptanzkriterien für die klinische Äquivalenz wurden als Nachweis einer 100% igen Übereinstimmung mit definiert
qualitative Ergebnisse mit der autorisierten Vergleichsmethode (QIAGEN EZ1 Advanced XL). Ergebnisse
Diese Studie ergab eine 100% ige Übereinstimmung mit der Vergleichsmethode für beide Roche MagNA Pure

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96 und Roche MagNA Pure 24 Extraktionsplattformen bei Verwendung mit dem CDC 2019-nCoV Real-Time RT-
PCR-Diagnose-Panel.
Tabelle 15. Klinische Vergleichsergebnisse - Retrospektive Studienergebnisse
Testplattform
Prüfung
Plattform
Ergebnis
QIAGEN EZ1
Advanced XL Result Positive% Agreement (CI) 1
Negative% Übereinstimmung (CI) 1
Positiv negativ
Roche MagNA
Pure 96
Positiv
14
0
100,0 (78,5 - 100,0)
100,0 (79,6 - 100,0)
Negativ
0
fünfzehn
Roche MagNA
Rein 24
Positiv
14
0
100,0 (78,5 - 100,0)
100,0 (79,6 - 100,0)
Negativ
0
fünfzehn
1 CI = 95% Konfidenzintervall
Bewertung der Promega Maxwell® RSC 48-Extraktionsplattform:
Leistung des Echtzeit-RT-PCR-Diagnose-Panels 2019-CoV mit dem Promega Maxwell® RSC 48
Die Extraktionsplattform wurde mit einer autorisierten Extraktionsmethode mit der Leistung verglichen. Seriennummer
Verdünnungen des quantifizierten inaktivierten SARS-CoV-2-Virus (USA-WA1 / 2020; 100 RNA-Kopien / µL) in VTM waren
zu gepoolter negativer Probenmatrix der oberen Atemwege hinzugefügt. Fünf Proben jeder Verdünnung waren
parallel mit dem QIAGEN EZ1® Advanced XL (EZ1 DSP-Virus-Kit Cat # 62724) und dem Promega extrahiert
Maxwell® RSC 48-Extraktion (Promega Maxwell® Viral Total Nucleic Acid Purification Kit, Kat. Nr. AS1330)
Plattformen und bewertet mit dem 2019-nCoV Echtzeit-RT-PCR-Diagnose-Panel und ThermoFisher
TaqPath ™ 1-Schritt RT-qPCR Master Mix. Die beobachtete LoD wurde als die niedrigste Konzentration bei definiert
welche 100% (5 von insgesamt 5) aller Replikate positiv für beide Primer / Sonden-Sets (N1 und N2) in getestet wurden
das CDC 2019-nCoV Echtzeit-RT-PCR-Diagnose-Panel. Die Akzeptanzkriterien für die Äquivalenz waren
definiert als Nachweis einer beobachteten LoD entweder am gleichen Endpunkt oder innerhalb einer dreifachen Verdünnung. Das
Die Ergebnisse zeigten, dass die Leistung der Maxwell® RSC 48-Extraktionsplattform erbracht wurde
äquivalent oder innerhalb einer dreifachen Verdünnung des LoD, die bei Verwendung des QIAGEN EZ1® Advanced XL beobachtet wurde
Absaugplattform.
Tabelle 16. Vergleichsgrenze Vergleich zwischen dem QIAGEN EZ1® Advanced XL und Promega
Maxwell® RSC 48-Extraktionsplattformen mit dem Echtzeit-RT-PCR-Diagnosepanel CDC 2019-nCoV
Plattform
Parameter
2019-nCoV_N1-Assay
2019-nCoV_N2-Assay
Beobachtete
LoD 1
QIAGEN EZ1®
Advanced XL
RNA-Kopien / µL
10 0,5
10 0.0
10 -0,5
10 0,5
10 0.0
10 -0,5
10 0.0
# pos./total
5/5
5/5
0/5
5/5
5/5
3/5
Mittlerer Ct 2
32.27
33,80
N / A
35.13
36.41
N / A
Std. Abweichung
0,81
0,40
N / A
0,81
0,40
N / A
Promega Maxwell®
RSC 48
RNA-Kopien / µL
10 0,5
10 0.0
10 -0,5
10 0,5
10 0.0
10 -0,5
10 0.0
# pos./total
5/5
5/5
3/5
5/5
5/5
5/5
Mittlerer Ct 2
31.11
32,97
N / A
31,89
33,95
35.17
Std. Abweichung
0,24
0,34
N / A
0,24
0,35
0,65
1 Die Konzentration wird in RNA-Kopien / µL angegeben. Die beobachtete LoD ist die niedrigste Konzentration, bei der beide Assays 100% zeigten
positive Erkennung.
2 Die mittlere Zyklusschwelle (Ct) wurde für Verdünnungen angegeben, die eine 100% ige Positivität aufweisen. Berechnungen beinhalten nur positive Ergebnisse.
NA = nicht anwendbar

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Zuvor charakterisierte klinische Restproben (15 positiv und 15 negativ) wurden unter Verwendung von extrahiert
die Promega Maxwell® RSC 48 Extraktionsplattform neben dem derzeit zugelassenen QIAGEN EZ1®
Erweiterte XL-Extraktionsplattform und Bewertung mithilfe des Echtzeit-RT-PCR-Diagnose-Panels 2019-nCoV
und ThermoFisher TaqPath ™ 1-Schritt RT-qPCR Master Mix. Ergebnisse aus dem Maxwell® RSC 48 waren
verglichen mit der parallel durchgeführten QIAGEN EZ1® Advanced XL-Extraktion mit 100% (15/15)
qualitative Übereinstimmung bei positiven Proben und 93,3% (14/15) qualitative Übereinstimmung bei negativen Proben
Proben. Diese Bewertung ergab, dass zwei ursprünglich negativ waren (QIAGEN QIAamp® DSP Viral RNA Mini Kit)
Proben (Proben 16 und 24) ergaben nach Extraktion mit dem QIAGEN EZ1® ein nicht schlüssiges Ergebnis
Advanced XL. Die Wiederholung des Echtzeit-RT-PCR-Diagnose-Panels CDC 2019-nCoV löste eines der beiden Probleme
Proben (Probe 24, negatives Ergebnis). Die zweite Probe (Probe 16) blieb nicht schlüssig.
Beide Proben ergaben beim Maxwell® RSC 48 ein negatives Ergebnis.
Tabelle 17. Klinische Vergleichsergebnisse - Retrospektive Studienergebnisse
Testplattform
Promega Maxwell ® RSC 48
Positiv%
Vereinbarung (CI) 1
Negativ%
Vereinbarung (CI) 1
Ergebnis
Positiv
Negativ
Nicht schlüssig
QIAGEN EZ1 ®
Advanced XL
Positiv
fünfzehn
0
0
100,0
(79,6-100,0)
93.3
(70,2-98,9)
Negativ
0
14
0
Nicht schlüssig
0
1
0
1 CI = 95% Konfidenzintervall
Verfügung
Entsorgen Sie gefährliche oder biologisch kontaminierte Materialien gemäß Ihren Praktiken
Institution.
Verweise
1. Ballew, HC et al . "Grundlegende Labormethoden in der Virologie", DHHS, Public Health Service 1975
(Überarbeitet 1981), Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, Georgia 30333.
2. Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI), „Sammlung, Transport, Vorbereitung und Lagerung von
Proben für molekulare Methoden: Vorgeschlagene Richtlinie “, MM13-A
3. Lieber, M. et al . Eine kontinuierliche Tumorzelllinie aus einem menschlichen Lungenkarzinom mit Eigenschaften von
Typ II Alveolar Epithelial Cells. " International Journal of Cancer 1976, 17 (1), 62-70.

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Versionsgeschichte
Revision #
Datum des Inkrafttretens
Zusammenfassung der Revisionen
1
4. Februar 2020
Original Gebrauchsanweisung
2
15. März 2020
• Update zur beabsichtigten Verwendung
• Entfernen des N3-Primers und des Sondensatzes aus dem Diagnosefeld
• Aktualisierung der Leistungsdaten
• Hinzufügen alternativer Nukleinsäureextraktionsplattformen
• Hinzufügung akzeptabler Alternativen zu HSC und Hinzufügung von
QIAGEN RUO Extraktionsreagenzien
• Positive Ergebnisse werden nicht mehr vermutet. Keine Bestätigung von
positive Ergebnisse erforderlich
3
30. März 2020
• Hinzufügen alternativer Enzym-Master-Mix-Optionen
4
12. Juni 2020
• Zugabe der MagNA Pure 24-Extraktionsmethode
• Hinzufügen von Leistungsdaten für den MagNA Pure 96
Extraktionsmethode mit SARS-CoV-2
• Zugabe einer Wärmebehandlungsalternative zur Probe
Extraktion
• Zugabe von externem Lysepuffer von Roche und QIAGEN
Alternativen
• Anerkennung der FDA-Richtlinien, die es Endbenutzern ermöglichen
alternative Komponenten qualifizieren, ohne eine EUA zu suchen oder
EUA-Änderung
5
13. Juli 2020
• Zugabe der Promega Maxwell® RSC 48-Extraktionsmethode
• Aktualisierung auf In-Silico- Inklusivitätsanalysen
Kontaktinformationen, Bestellung und Produktsupport
Wenden Sie sich für technische Unterstützung und Produktunterstützung direkt an die CDC-Abteilung für Viruserkrankungen.
E-Mail senden an: respvirus@cdc.gov
Hinweis: Wenn Ihr Labor Reagenzien verwendet, die von einer anderen Person als CDC International stammen
Reagenzienressource, beachten Sie bitte die Anweisungen des Herstellers, die mit dem Werbespot geliefert wurden
Materialien.

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Anhang A: Wärmebehandlungsalternative zur Extraktion
UltraPlex 1-Schritt ToughMix (4X)
Dieses Verfahren ist nur für Laboratorien des öffentlichen Gesundheitswesens vorgesehen.
Zweck:
In Reaktion auf einen weltweiten Mangel an Nukleinsäureextraktionsreagenzien, der zu erheblichen Verzögerungen beim Testen führt,
Die CDC hat die Verwendung einer Wärmebehandlungsmethode untersucht, bei der nur minimale Reagenzien als Probe erforderlich sind
Verarbeitungsalternative zur Nukleinsäureextraktion zur Verwendung mit der 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic
Panel.
Wenn möglich, sollten Laboratorien qualifizierte RNA- oder Gesamtnukleinsäureextraktionsmethoden für verwenden
Verarbeitung von Proben für nachfolgende Tests durch die CDC 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic
Panel. Die Extraktion entfernt inhibitorische Substanzen aus Proben, die die PCR negativ beeinflussen könnten
Performance.
Dieses Verfahren zur Verwendung der Wärmebehandlung für die Probenverarbeitung wird nur empfohlen, wenn a
Der Mangel an qualifizierten Extraktionsreagenzien ist ein begrenzender Faktor für die Fähigkeit eines Labors, dringende Anforderungen zu erfüllen
COVID-19-Testanforderung.
Vorsichtsmaßnahmen / Warnungen / Einschränkungen:
• CDC hat diesen Wärmebehandlungsprozess bewertet und festgestellt, dass dieser Prozess effektiv ist
zur Inaktivierung von SARS-CoV-2 in Patientenproben.
• Die Leistung wurde nur mit Proben der oberen Atemwege bewertet. Wärmebehandlung von unteren
Atemproben für nachfolgende Tests mit der CDC 2019-nCoV Real-Time RT-PCR
Diagnose-Panel wurde nicht ausgewertet.
• Dieses Verfahren zur Wärmebehandlung von Proben ist nur für den Quantabio UltraPlex 1- vorgesehen.
Schritt ToughMix (4X).
• Eine Wärmebehandlung sollte nur durchgeführt werden, wenn ein Labor bereit ist, die Proben mittels PCR zu testen.
Die Prüfung von wärmebehandelten Proben muss am selben Tag durchgeführt werden.
Akzeptable Proben:
• Proben der oberen Atemwege
Hinweis: Verwenden Sie keine Wärmebehandlung, um Proben zu verarbeiten, die blutig erscheinen oder enthalten
Feinstaub. Solche Proben sollten mit einer qualifizierten RNA- oder TNA-Extraktion extrahiert werden
Methode vor dem Testen.
Erforderliche Materialien (nicht bereitgestellt):
• 70% Ethanol
• 10% Bleichmittel, frisch zubereitet
• 96-Well-PCR-Reaktionsplatten (Applied Biosystems-Katalog Nr. 4346906, 4366932, 4346907 oder
gleichwertig)
• Optische Streifenkappen (Applied Biosystems 4323032 oder gleichwertig)
• 1,5-ml-Sarstedt-Röhrchen oder gleichwertig

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• Aerosolresistente Mikropipettenspitzen
• Mikropipetten
• 96-Well-Kühlblock
• Kühlblöcke für 1,5 ml - 2,0 ml Röhrchen
• Vortexmixer
• 96-Well-Plattenzentrifuge oder gleichwertig
• Thermocycler oder gleichwertig
• Biologischer Sicherheitsschrank der Klasse II (BSC)
Verfahren:
Probenvorbereitung
1) BSC mit 10% Bleichmittel und 70% Ethanol dekontaminieren.
2) Wenn die Proben gefroren sind, tauen Sie sie auf Eis oder bei 4 ° C auf. Wischen Sie die Außenseite des Probenröhrchens mit 70% ab
Ethanol. Legen Sie die aufgetaute Probe auf ein kaltes Gestell oder Eis in BSC.
3) Jede Probe pulsieren und kurz in einer Zentrifuge drehen, um die Flüssigkeit am zu sammeln
Boden der Röhre.
Wärmebehandlung
1) Stellen Sie einen Thermocycler in die BSC, schalten Sie ihn ein und programmieren Sie 1 Minute lang auf 95 ° C, gefolgt von 4 ° C.
halt.
2) Legen Sie eine 96-Well-PCR-Platte auf ein kaltes Gestell oder Eis in der BSC.
3) Übertragen Sie 100 µl jeder Probe auf die PCR-Platte mit 96 Vertiefungen und verschließen Sie jede Vertiefung sicher mit
optische Streifenkappen.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass in jedem Chargenlauf eine HSC-Extraktionskontrolle enthalten ist, wie unter erforderlich
CLIA.
4) Legen Sie diese 96-Well-PCR-Platte auf den vorgewärmten Thermocycler und starten Sie den Lauf. Platte anlassen
Thermocycler bei 4 ° C oder auf Eis oder einen kalten Block stellen.
5) Platte entfernen und 1 Minute bei 500 xg zentrifugieren, um Zelltrümmer zu pelletieren.
6) Legen Sie die Platte auf ein kaltes Gestell oder Eis und fahren Sie mit dem Testen des Überstands durch rRT-PCR fort.
7) Die Prüfung von wärmebehandelten Proben muss am selben Tag durchgeführt werden, an dem die Wärmebehandlung stattfindet
durchgeführt. Bewahren Sie die Originalprobe zur Langzeitlagerung bei ≤-70 ° C auf.
Besondere Testüberlegungen für wärmebehandelte Proben:
Enzym-Master-Mix
Es sollten Tests von Proben durchgeführt werden, die mit einer Wärmebehandlung verarbeitet wurden
mit dem Quantabio UltraPlex 1-Step ToughMix (4X) , der das Beste demonstrierte
Leistung mit wärmebehandelten Proben. PCR-Tests von wärmebehandelten Proben sollten
Befolgen Sie die Anweisungen im Hauptteil dieser Gebrauchsanweisung.
Auflösung nicht eindeutiger und ungültiger Ergebnisse
Die erneute Prüfung von wärmebehandelten Proben, die zu einem nicht eindeutigen oder ungültigen Ergebnis geführt haben, muss erfolgen
umfassen die Extraktion der Originalprobe mit einer qualifizierten RNA oder Gesamtnukleinsäure (TNA)
Extraktionsmethode, falls verfügbar. Testen Sie das wärmebehandelte Probenmaterial nicht erneut, um es aufzulösen
nicht eindeutige oder ungültige Testergebnisse.

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Überprüfung:
CDC empfiehlt die Durchführung von Verifizierungsstudien für die Wärmebehandlungsmethode vor der Diagnose
Verwendung, die die gleichzeitige Vorbereitung einer Gruppe positiver und negativer klinischer Proben unter Verwendung von a umfasst
qualifizierte Extraktionsmethode und diese Wärmebehandlungsmethode mit anschließenden Tests durch die CDC 2019-
nCoV Echtzeit-RT-PCR-Diagnosefeld.
Leistungsmerkmale:
Quantabio UltraPlex 1-Schritt ToughMix (4X)
Vergleichsgrenze Vergleich
Serienverdünnungen von inaktiviertem SARS-CoV-2 [SARS-CoV-2 USA-WA1 / 2020] wurden simuliert hergestellt
Probenmaterial (humane A549-Zellen, suspendiert in viralem Transportmedium). Jede Konzentration war
fünfmal nebeneinander hergestellt, sowohl durch EZ1-Extraktion als auch durch Wärmebehandlung. Jeder extrahiert oder erhitzt
Die behandelte Probe wurde anschließend vom CDC 2019-nCoV-Echtzeit-RT-PCR-Diagnosepanel unter Verwendung von getestet
der Quantabio UltraPlex 1-Step ToughMix (4X) auf dem Applied Biosystems 7500 Fast Dx Instrument.
Der beobachtete Nachweis war zwischen den beiden Probenvorbereitungsmethoden ähnlich.
Tabelle B1: Vergleich der UltraPlex-Nachweisgrenze zwischen QIAGEN EZ1 Advanced XL-Extraktion und Wärme
Behandlungsmethode (95 ° C für 1 min) - Zusammenfassung der Ergebnisse
Enzymplattform
Parameter
2019-nCoV_N1-Assay
2019-nCoV_N2-Assay
Beobachtete
LoD 1
Qu
ein
n
ta
b
io
U.
ltra
P.
le
x 1
- -
Ste
p
T.
Ö
u
gh
M.
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5 µ
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te
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d
d
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n
QIAG
E.
N.
E.
Z1
EIN
d
va
n
ce
d
XL
RNA-Kopien / µL 10 1,0
10 0,5
10 0.0
10 -0,5
10 -1,0
10 1.0
10 0,5
10 0.0
10 -0,5
10 -1,0
10 0,5
# pos./total
5/5 5/5 4/5 4/5 3/5 5/5 5/5 5/5 2/5 2/5
Mittlerer Ct 2
34,11 34,59 NA NA NA 32,97 33,76 34,70 NA NA
Std. Abweichung
0,75 0,99 NA NA NA 0,33 0,72 0,98 NA NA
H.
e
ein
t
T.
Re
ein
tme
n
t
95 ° C.
fo
r 1 min
RNA-Kopien / µL 10 1,0
10 0,5
10 0.0
10 -0,5
10- 1.0
10 1.0
10 0,5
10 0.0
10 -0,5
10 -1,0
10 0,5
# pos./total
5/5 5/5 4/5 5/5 1/5 5/5 5/5 4/5 2/5 1/5
Mittlerer Ct 2
33,41 34,32 NA 36,73 NA 33,45 35,25 NA NA NA
Std. Abweichung
0,62 0,40 NA 0,82 NA 0,40 0,80 NA NA NA
1 Die Konzentration wird in RNA-Kopien / µL angegeben. Die beobachtete LoD ist die niedrigste Konzentration, bei der beide Assays 100% zeigten
positive Erkennung.
2 Der mittlere Ct wurde für Verdünnungen angegeben, die eine 100% ige Positivität zeigen. Berechnungen beinhalten nur positive Ergebnisse.
NA = nicht anwendbar

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CDC / DDID / NCIRD / Abteilung für Viruserkrankungen
Gültig ab: 13.07.2020
Klinischer Vergleich
Eine Gruppe von 39 Proben der oberen Atemwege wurde nebeneinander mittels Extraktion mit dem Qiagen EZ1 getestet
Extraktionsinstrument und Wärmebehandlung. Anschließend wurden extrahierte und wärmebehandelte Proben entnommen
getestet mit dem CDC 2019-nCoV Echtzeit-RT-PCR-Diagnose-Panel unter Verwendung des Quantabio UltraPlex 1-Step
ToughMix (4X). Qualitative Ergebnisse wurden verglichen, um Übereinstimmung zu zeigen.
Tabelle B2: Zusammenfassung der Ergebnisse des klinischen Vergleichs - Wärmebehandlung im Vergleich zu QIAGEN EZ1 Advanced XL
Testergebnis
Wärmebehandlung
Gesamt
Positiv%
Vereinbarung (CI) 1
Negativ%
Vereinbarung (CI) 1
Positiv Nicht schlüssig Negativ
QIAGEN EZ1
Advanced XL
Positiv
18
1
0
19
94,7 (75,4-99,1)
100 (83,9-100)
Nicht schlüssig
0
0
0
0
Negativ
0
0
20
20
Gesamt
18
1
20
39
1 CI = 95% Konfidenzintervall
Fragen und Kommentare:
Wenn Sie Fragen oder Kommentare zu diesem Verfahren haben, senden Sie diese bitte per E-Mail an: respvirus@cdc.gov

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Abteilung für Viruskrankheiten / Atemwegsviren
CDC 2019-nCoV Echtzeit-RT-PCR-Diagnosefeld - Überprüfung
Bedarf
*** NICHT ENTSORGEN: Wichtige produktspezifische Informationen ***
Dokumentnummer: CDC-006-00005
Revisionsnummer: 05
Datum des Inkrafttretens: 13.07.2020
Seite 1 von 4
CDC 2019-nCoV Echtzeit-RT-PCR-Diagnose-Panel -
Überprüfungsanforderungen
Bitte konsultieren Sie die folgenden Anleitungen der Centers for Medicare & Medicaid Services
(CMS) zu Diagnosetests unter Emergency Use Authorization (EUA):
https://www.cms.gov/Medicare/Provider-Enrollment-and-
Certification / SurveyCertificationGenInfo / Policy-and-Memos-to-States-and-Regions-
Artikel / QSO18-19-CLIA
VERWENDUNGSZWECK
Das Echtzeit-RT-PCR-Diagnose-Panel des CDC 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) ist ein echtes
Zeit-RT-PCR-Test zum qualitativen Nachweis von Nukleinsäuren aus dem 2019-nCoV in
Proben der oberen und unteren Atemwege (wie Nasopharyngeal- oder Oropharyngealabstriche,
Sputum, Aspirate der unteren Atemwege, bronchoalveoläre Lavage und Nasopharyngeal
Waschen / Aspirieren oder Nasenaspirieren) von Personen, die die klinische 2019-nCoV erfüllen
und / oder epidemiologische Kriterien (zum Beispiel klinische Anzeichen und Symptome im Zusammenhang mit
2019-nCoV-Infektion, Kontakt mit einem wahrscheinlichen oder bestätigten 2019-nCoV-Fall, Reisegeschichte
an einen geografischen Ort, an dem Fälle von 2019-nCoV entdeckt wurden, oder an andere epidemiologische Verbindungen
für die 2019-nCoV-Tests im Rahmen einer Untersuchung der öffentlichen Gesundheit angezeigt werden können). Testen
in den Vereinigten Staaten ist auf Laboratorien beschränkt, die nach dem Clinical Laboratory zertifiziert sind
Verbesserungsänderungen von 1988 (CLIA), 42 USC § 263a, um eine hohe Komplexität zu erreichen
Tests.
Die Ergebnisse beziehen sich auf die Identifizierung von 2019-nCoV-RNA. Die 2019-nCoV-RNA ist im Allgemeinen
während der Infektion in Proben der oberen und unteren Atemwege nachweisbar. Positive Ergebnisse sind
Dies deutet auf eine aktive Infektion mit 2019-nCoV hin, schließt jedoch eine bakterielle Infektion oder Co-Infektion nicht aus
Infektion mit anderen Viren. Der nachgewiesene Wirkstoff ist möglicherweise nicht die eindeutige Ursache der Krankheit.
Laboratorien in den Vereinigten Staaten und ihren Territorien sind verpflichtet, alle positiven Ergebnisse zu melden
Ergebnisse an die zuständigen Gesundheitsbehörden.
Negative Ergebnisse schließen eine 2019-nCoV-Infektion nicht aus und sollten nicht als alleinige Grundlage verwendet werden
für die Behandlung oder andere Entscheidungen des Patientenmanagements. Negative Ergebnisse müssen mit kombiniert werden
klinische Beobachtungen, Anamnese und epidemiologische Informationen.
Das Testen mit dem Echtzeit-RT-PCR-Diagnosepanel CDC 2019-nCoV ist für die Verwendung durch vorgesehen
geschultes Laborpersonal, das in der Durchführung von Echtzeit-RT-PCR-Assays kompetent ist. Das
Das Echtzeit-RT-PCR-Diagnose-Panel CDC 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) ist nur zur Verwendung vorgesehen
unter der Emergency Use Authorization einer Food and Drug Administration.
BENÖTIGTES MATERIAL
Die neuartige Coronavirus-Positivkontrolle 2019 (nCoVPC) wird mit der CDC 2019-nCoV geliefert
Echtzeit-RT-PCR-Diagnose-Panel und sollte gemäß den Anweisungen für vorbereitet werden
Verwenden. Das nCoVPC besteht aus einem RNA-Transkript des 2019-nCoV N-Gens sowie aus dem Menschen
RNase P-Gensegment. nCoVPC liefert mit dem folgenden Primer und der folgenden Sonde ein positives Ergebnis
Sätze: 2019-nCoV_N1, 2019-nCoV_N2 und RP.
Ungefähr 2 ml einer Probe der oberen Atemwege (z. B. Nasopharyngealabstrich (NPS) in
Transportmedien) werden zum Testen benötigt. Proben können gepoolt werden, wenn weniger als 2 ml von einer vorhanden sind
Probe ist vorhanden.
Siehe CDC 2019-nCoV Echtzeit-RT-PCR-Diagnosepanel-Packungsbeilage (Hersteller)
Anweisungen) für zusätzliche Reagenzien, Materialien und Anweisungen.
VORSICHTSMASSNAHMEN
Dieses Reagenz sollte in einem zugelassenen Bereich der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) gehandhabt werden
Vermeiden Sie Kontaminationen von Laborgeräten und Reagenzien, die zu falsch positiven Ergebnissen führen können

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Abteilung für Viruskrankheiten / Atemwegsviren
CDC 2019-nCoV Echtzeit-RT-PCR-Diagnosefeld - Überprüfung
Bedarf
*** NICHT ENTSORGEN: Wichtige produktspezifische Informationen ***
Dokumentnummer: CDC-006-00005
Revisionsnummer: 05
Datum des Inkrafttretens:
Seite 2 von 4
Ergebnisse. Dieses Produkt ist ein RNA-Transkript und nicht infektiös. Der nCoVPC sollte jedoch
in Übereinstimmung mit den guten Laborpraktiken gehandhabt werden.
Lagern Sie das Reagenz bei geeigneten Temperaturen (siehe Gebrauchsanweisung) und halten Sie es auf Eis, wenn
aufgetaut.
Bitte treffen Sie beim Umgang mit Atemwegsproben die üblichen Vorsichtsmaßnahmen.
ANWEISUNGEN ZUR VORBEREITUNG DER PROBEN VOR DER EXTRAKTION MIT DEM
QIAamp ® DSP VIRAL RNA MINI KIT ODER DAS QIAamp ® VIRAL RNA MINI KIT
• Lesen Sie die Gebrauchsanweisung für das 2019-nCoV-Echtzeit-RT-PCR-Diagnosefeld
Rekonstitution der zu verwendenden Materialien. Die RNA sollte während der Herstellung und Verwendung kalt gehalten werden.
• Nehmen Sie eine 1/10-Verdünnung von nCoVPC vor, indem Sie 5 µl nCoVPC in 45 µl nukleasefreies Wasser geben
oder 10 mM Tris.
• 560 µl Lysepuffer in jedes der neun mit 1-9 gekennzeichneten Röhrchen aliquotieren.
• Fügen Sie jeweils 140 µl Probe der oberen Atemwege (z. B. NPS in viralen Transportmedien) hinzu
die neun markierten Röhrchen mit Lysepuffer.
• Um Proben in einer moderaten Konzentration vorzubereiten, geben Sie 14 µl unverdünntes nCoVPC auf
(rehydratisiert wie im Echtzeit-RT-PCR-Diagnosepanel CDC 2019-nCoV beschrieben
Gebrauchsanweisung) in jedes mit 1-3 gekennzeichnete Röhrchen, das Lysepuffer und Probe enthält.
• Um Proben in einer niedrigen Konzentration vorzubereiten, geben Sie 14 µl 1/10 Verdünnung von nCoVPC in
Jedes mit 4-6 bezeichnete Röhrchen enthielt Lysepuffer und Probe.
• Um negative Proben herzustellen, geben Sie 14 µl Nuklease-freies Wasser in jedes mit 7-9 gekennzeichnete Röhrchen
Lysepuffer und Probe enthaltend.
• Führen Sie Extraktionen aller neun Proben gemäß der CDC 2019-nCoV-Echtzeit-RT-PCR durch
Gebrauchsanweisung des Diagnosefelds.
ANWEISUNGEN ZUR VORBEREITUNG DER PROBEN VOR DER EXTRAKTION MIT DEM QIAGEN
EZ1 ® ADVANCED XL
• Lesen Sie die Gebrauchsanweisung für das 2019-nCoV-Echtzeit-RT-PCR-Diagnosefeld
Rekonstitution der zu verwendenden Materialien. Die RNA sollte während der Herstellung und Verwendung kalt gehalten werden.
• Nehmen Sie eine 1/10-Verdünnung von nCoVPC vor, indem Sie 5 µl nCoVPC in 45 µl nukleasefreies Wasser geben
oder 10 mM Tris.
• 280 µl Lysepuffer in jedes der neun mit 1-9 gekennzeichneten Röhrchen aliquotieren.
• Fügen Sie jeweils 120 µl Probe der oberen Atemwege (z. B. NPS in viralen Transportmedien) hinzu
die neun markierten Röhrchen mit Lysepuffer.
• Um Proben in einer moderaten Konzentration vorzubereiten, geben Sie 12 µl unverdünntes nCoVPC auf
(rehydratisiert wie im Echtzeit-RT-PCR-Diagnosepanel CDC 2019-nCoV beschrieben
Gebrauchsanweisung) in jedes mit 1-3 gekennzeichnete Röhrchen, das Lysepuffer und Probe enthält.
• Um Proben in einer niedrigen Konzentration vorzubereiten, geben Sie 12 µl 1/10 Verdünnung von nCoVPC in
Jedes mit 4-6 bezeichnete Röhrchen enthielt Lysepuffer und Probe.
• Um negative Proben herzustellen, geben Sie 12 µl nukleasefreies Wasser in jedes mit 7-9 gekennzeichnete Röhrchen
Lysepuffer und Probe enthaltend.
• Führen Sie Extraktionen aller neun Proben gemäß der CDC 2019-nCoV-Echtzeit-RT-PCR durch
Gebrauchsanweisung des Diagnosefelds.
ANWEISUNGEN ZUR VORBEREITUNG DER PROBEN VOR DER EXTRAKTION MIT DER ROCHE
MagNA PURE TOTAL NUCLEIC ACID KIT ODER DIE ROCHE MagNA PURE NUCLEIC ACID
ISOLATION KIT I.
• Lesen Sie die Gebrauchsanweisung für das 2019-nCoV-Echtzeit-RT-PCR-Diagnosefeld
Rekonstitution der zu verwendenden Materialien. Die RNA sollte während der Herstellung und Verwendung kalt gehalten werden.
• Nehmen Sie eine 1/10-Verdünnung von nCoVPC vor, indem Sie 5 µl nCoVPC in 45 µl nukleasefreies Wasser geben
oder 10 mM Tris.
• 300 µl Lysepuffer in jedes der neun mit 1-9 gekennzeichneten Röhrchen aliquotieren.
• Fügen Sie jeweils 100 µl Probe der oberen Atemwege (z. B. NPS in viralen Transportmedien) hinzu
die neun markierten Röhrchen mit Lysepuffer.

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Abteilung für Viruskrankheiten / Atemwegsviren
CDC 2019-nCoV Echtzeit-RT-PCR-Diagnosefeld - Überprüfung
Bedarf
*** NICHT ENTSORGEN: Wichtige produktspezifische Informationen ***
Dokumentnummer: CDC-006-00005
Revisionsnummer: 05
Datum des Inkrafttretens:
Seite 3 von 4
• Um Proben in einer moderaten Konzentration vorzubereiten, geben Sie 12 µl unverdünntes nCoVPC auf
(rehydratisiert wie im Echtzeit-RT-PCR-Diagnosepanel CDC 2019-nCoV beschrieben
Gebrauchsanweisung) in jedes mit 1-3 gekennzeichnete Röhrchen, das Lysepuffer und Probe enthält.
• Um Proben in einer niedrigen Konzentration vorzubereiten, geben Sie 12 µl 1/10 Verdünnung von nCoVPC in
Jedes mit 4-6 bezeichnete Röhrchen enthielt Lysepuffer und Probe.
• Um negative Proben herzustellen, geben Sie 12 µl nukleasefreies Wasser in jedes mit 7-9 gekennzeichnete Röhrchen
Lysepuffer und Probe enthaltend.
• Führen Sie Extraktionen aller neun Proben gemäß der CDC 2019-nCoV-Echtzeit-RT-PCR durch
Gebrauchsanweisung des Diagnosefelds.
ANWEISUNGEN ZUR VORBEREITUNG DER PROBEN VOR DER EXTRAKTION MIT DER ROCHE
MagNA PURE 24 UND TOTAL NUCLEIC ACID ISOLATION KIT
• Lesen Sie die Gebrauchsanweisung für das 2019-nCoV-Echtzeit-RT-PCR-Diagnosefeld
Rekonstitution der zu verwendenden Materialien. Die RNA sollte während der Herstellung und Verwendung kalt gehalten werden.
• Nehmen Sie eine 1/10-Verdünnung von nCoVPC vor, indem Sie 5 µl nCoVPC in 45 µl nukleasefreies Wasser geben
oder 10 mM Tris.
• Aliquotieren Sie 400 µl Lysepuffer in jedes der neun mit 1-9 gekennzeichneten Röhrchen.
• Fügen Sie jeweils 100 µl Probe der oberen Atemwege (z. B. NPS in viralen Transportmedien) hinzu
die neun markierten Röhrchen mit Lysepuffer.
• Um Proben in einer moderaten Konzentration vorzubereiten, geben Sie 12 µl unverdünntes nCoVPC auf
(rehydratisiert wie im Echtzeit-RT-PCR-Diagnosepanel CDC 2019-nCoV beschrieben
Gebrauchsanweisung) in jedes mit 1-3 gekennzeichnete Röhrchen, das Lysepuffer und Probe enthält.
• Um Proben in einer niedrigen Konzentration vorzubereiten, geben Sie 12 µl 1/10 Verdünnung von nCoVPC in
Jedes mit 4-6 bezeichnete Röhrchen enthielt Lysepuffer und Probe.
• Um negative Proben herzustellen, geben Sie 12 µl nukleasefreies Wasser in jedes mit 7-9 gekennzeichnete Röhrchen
Lysepuffer und Probe enthaltend.
• Führen Sie Extraktionen aller neun Proben gemäß der CDC 2019-nCoV-Echtzeit-RT-PCR durch
Gebrauchsanweisung des Diagnosefelds.
ANWEISUNGEN ZUR VORBEREITUNG DER PROBEN VOR DER EXTRAKTION MIT DER ROCHE
MagNA PURE 96 DNA UND VIRAL NA SMALL VOLUME KIT
• Lesen Sie die Gebrauchsanweisung für das 2019-nCoV-Echtzeit-RT-PCR-Diagnosefeld
Rekonstitution der zu verwendenden Materialien. Die RNA sollte während der Herstellung und Verwendung kalt gehalten werden.
• Nehmen Sie eine 1/10-Verdünnung von nCoVPC vor, indem Sie 5 µl nCoVPC in 45 µl nukleasefreies Wasser geben
oder 10 mM Tris.
• 350 µl Lysepuffer in jedes der neun mit 1-9 gekennzeichneten Röhrchen aliquotieren.
• Fügen Sie jeweils 100 µl Probe der oberen Atemwege (z. B. NPS in viralen Transportmedien) hinzu
die neun markierten Röhrchen mit Lysepuffer.
• Um Proben in einer moderaten Konzentration vorzubereiten, geben Sie 12 µl unverdünntes nCoVPC auf
(rehydratisiert wie im Echtzeit-RT-PCR-Diagnosepanel CDC 2019-nCoV beschrieben
Gebrauchsanweisung) in jedes mit 1-3 gekennzeichnete Röhrchen, das Lysepuffer und Probe enthält.
• Um Proben in einer niedrigen Konzentration vorzubereiten, geben Sie 12 µl 1/10 Verdünnung von nCoVPC in
Jedes mit 4-6 bezeichnete Röhrchen enthielt Lysepuffer und Probe.
• Um negative Proben herzustellen, geben Sie 12 µl nukleasefreies Wasser in jedes mit 7-9 gekennzeichnete Röhrchen
Lysepuffer und Probe enthaltend.
• Führen Sie Extraktionen aller neun Proben gemäß der CDC 2019-nCoV-Echtzeit-RT-PCR durch
Gebrauchsanweisung des Diagnosefelds.
ANWEISUNGEN ZUR VORBEREITUNG DER PROBEN VOR DER EXTRAKTION MIT DEM
PROMEGA MAXWELL ® RSC 48
• Lesen Sie die Gebrauchsanweisung für das 2019-nCoV-Echtzeit-RT-PCR-Diagnosefeld
Rekonstitution der zu verwendenden Materialien. Die RNA sollte während der Herstellung und Verwendung kalt gehalten werden.
• Nehmen Sie eine 1/10-Verdünnung von nCoVPC vor, indem Sie 5 µl nCoVPC in 45 µl nukleasefreies Wasser geben
oder 10 mM Tris.
• Aliquot 330 µl Lysepuffer (300 µl Lysepuffer + 30 µl Proteinase K, enthalten in der
Kit) in jedes der neun Röhrchen mit der Bezeichnung 1-9.

Seite 59
Abteilung für Viruskrankheiten / Atemwegsviren
CDC 2019-nCoV Echtzeit-RT-PCR-Diagnosefeld - Überprüfung
Bedarf
*** NICHT ENTSORGEN: Wichtige produktspezifische Informationen ***
Dokumentnummer: CDC-006-00005
Revisionsnummer: 05
Datum des Inkrafttretens:
Seite 4 von 4
• Fügen Sie jeweils 120 µl Probe der oberen Atemwege (z. B. NPS in viralen Transportmedien) hinzu
die neun markierten Röhrchen mit Lysepuffer.
• Um Proben in einer moderaten Konzentration vorzubereiten, geben Sie 12 µl unverdünntes nCoVPC auf
(rehydratisiert wie im Echtzeit-RT-PCR-Diagnosepanel CDC 2019-nCoV beschrieben
Gebrauchsanweisung) in jedes mit 1-3 gekennzeichnete Röhrchen, das Lysepuffer und Probe enthält.
• Um Proben in einer niedrigen Konzentration vorzubereiten, geben Sie 12 µl 1/10 Verdünnung von nCoVPC in
Jedes mit 4-6 bezeichnete Röhrchen enthielt Lysepuffer und Probe.
• Um negative Proben herzustellen, geben Sie 12 µl nukleasefreies Wasser in jedes mit 7-9 gekennzeichnete Röhrchen
Lysepuffer und Probe enthaltend.
• Führen Sie Extraktionen aller neun Proben gemäß der CDC 2019-nCoV-Echtzeit-RT-PCR durch
Gebrauchsanweisung des Diagnosefelds.
ANWEISUNGEN ZUR VORBEREITUNG DER PROBEN VOR DER EXTRAKTION MIT DEM
BIOMÉRIEUX NucliSENS easyMAG ODER BIOMÉRIEUX EMAG
• Lesen Sie die Gebrauchsanweisung für das 2019-nCoV-Echtzeit-RT-PCR-Diagnosefeld
Rekonstitution der zu verwendenden Materialien. Die RNA sollte während der Herstellung und Verwendung kalt gehalten werden.
• Nehmen Sie eine 1/10-Verdünnung von nCoVPC vor, indem Sie 5 µl nCoVPC in 45 µl nukleasefreies Wasser geben
oder 10 mM Tris.
• 1000 μl oder 2000 μl voraliquotierten easyMAG-Lysepuffer in jedes der neun Röhrchen aliquotieren
beschriftet mit 1-9 für easyMAG bzw. eMAG.
• Fügen Sie jeweils 100 µl Probe der oberen Atemwege (z. B. NPS in viralen Transportmedien) hinzu
die neun markierten Röhrchen mit Lysepuffer.
• Um Proben in einer moderaten Konzentration vorzubereiten, geben Sie 12 µl unverdünntes nCoVPC auf
(rehydratisiert wie im Echtzeit-RT-PCR-Diagnosepanel CDC 2019-nCoV beschrieben
Gebrauchsanweisung) in jedes mit 1-3 gekennzeichnete Röhrchen, das Lysepuffer und Probe enthält.
• Um Proben in einer niedrigen Konzentration vorzubereiten, geben Sie 12 µl 1/10 Verdünnung von nCoVPC in
Jedes mit 4-6 bezeichnete Röhrchen enthielt Lysepuffer und Probe.
• Um negative Proben herzustellen, geben Sie 12 µl nukleasefreies Wasser in jedes mit 7-9 gekennzeichnete Röhrchen
Lysepuffer und Probe enthaltend.
• Führen Sie Extraktionen aller neun Proben gemäß der CDC 2019-nCoV-Echtzeit-RT-PCR durch
Gebrauchsanweisung des Diagnosefelds.
VERFAHREN
Befolgen Sie zum Testen die Anweisungen des CDC 2019-nCoV-Echtzeit-RT-PCR-Diagnosefelds zur Verwendung
die neun extrahierten Proben mindestens einmal.
ERWARTETE ERGEBNISSE
Moderate nCoVPC-Proben sollten für 2019-nCoV positiv sein.
Proben mit niedrigem nCoVPC sollten für 2019-nCoV positiv sein.
Negative Proben der oberen Atemwege sollten für 2019-nCoV negativ sein.
≥90% der Testergebnisse sollten mit den erwarteten Ergebnissen übereinstimmen. Wenn Testergebnisse sind
<90% in Übereinstimmung mit den erwarteten Ergebnissen, wenden Sie sich an CDC unter respvirus@cdc.gov .
FRAGEN
Bitte senden Sie Fragen oder Kommentare per E-Mail an respvirus@cdc.gov .
VERTEILUNG
Von Zentren für die Kontrolle und Prävention von Krankheiten, 1600, an qualifizierte Laboratorien verteilt
Clifton Road, Atlanta, GA, 30329 USA